實驗九、十 酶聯(lián)免疫吸附試驗課件

實驗九酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA

實驗十IgG的分離和純化程燕2014年6月9日實驗九酶聯(lián)免疫吸附試

（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）實驗?zāi)康?.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、種類和用途。

2.學(xué)習(xí)用酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗體夾心法檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。

3.了解HBsAg陽性的意義。實驗原理

將已知抗體（或抗原）結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原）按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體（或抗原）發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進行定性或定量測定。

實驗原理ELISA的基本原理有三條：

（1）抗原或抗體能以物理性（疏水性）地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。

實驗原理常用酶聯(lián)免疫吸附試驗有間接法競爭法雙抗體夾心法用于抗原及半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測抗原和一定量的已知酶標(biāo)抗原，使二者競爭地與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。固相抗體EEE酶標(biāo)抗原待測抗原E底物E顯色反應(yīng)（弱）固相抗體EEE酶標(biāo)抗原底物顯色反應(yīng)（強）EEEEEEELISA-競爭法

ELISA-雙抗體夾心法雙抗體夾心法常用于檢測抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體及底物溶液進行測定。酶標(biāo)抗體固相抗體待測抗原EEE

雙抗體夾心法檢測抗原實驗材料1、乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒定性檢測人血清或血漿中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包括：HBsAg特異性抗體（一抗）已包被于酶標(biāo)板上

HBsAg陰、陽性血清各1份、酶標(biāo)抗體（二抗）1份，顯色劑A、B各1份，終止液1份，洗滌液1份，2、待檢血清5份3、微量加樣器（10-100ul）及匹配的槍頭4、廢液缸注意：有污染性。酶：辣根過氧化物酶(HRP)底物：3,3‘,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在辣根過氧化物酶催化下，TMB會產(chǎn)生可溶性藍(lán)色產(chǎn)物。使用2M

H2SO4終止反應(yīng)，在

450nm測定吸光度。結(jié)果判斷

1、定性：夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。2、P/N值≥2.1者判為HBsAg陽性；P/N值＜2.1者判為陰性。介于中間為可疑。S：待測樣本OD值COV：cut-offvalue=NCx+0.100NCx：陰性對照OD值的均值陽性判定值=S/COV≧1.0：陽性﹤1.0：陰性實驗十IgG的分離和純化實驗?zāi)康膶嵺`IgG分離純化過程了解分離、純化抗體的原理比較成年牛血清與新生牛血清中IgG的含量（眼觀）實驗原理利用蛋白質(zhì)鹽析原理，分離血清中的IgG:

不同蛋白質(zhì)在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同，因此，可利用不同濃度的鹽溶液使血清中的各個蛋白質(zhì)成分分別析出。一般pH7.0時，50％硫酸銨飽和度可將所有的5種Ig（球蛋白）沉淀出來。33％飽和度大部分IgG可沉淀出來。意義：制備出的純化IgG，可用于酶標(biāo)抗體或熒光抗體的制備。實驗器材1．動物抗血清：成年牛血清、新生牛血清2．硫酸銨飽和溶液、0.01mol/L的PBS3．冰箱、離心機、電磁攪拌器、天平、尼龍繩等。

實驗步驟1.取xml血清（2ml），加等量0.01mol/L的PBS稀釋，攪拌下逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液2Xml（4ml），邊加邊攪拌，4℃靜置30分鐘以上，使其充分沉淀。2.離心：3000～4000r/min離心20min，棄上清。3.以0.01mol/L的PBS溶解沉淀至Xml（5ml），再逐滴加入飽和(NH4)2SO4X/2ml（2.5ml)。置4℃，30～60分鐘。4.再離心：3000r～4000r/min離心20min，棄上清。5.重復(fù)上述第3、