第三章 酶的分離純化

Chapter3

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的分離純化制作：崔建東cjd007cn@163.comContentsofchapter31、酶的提取與分離純化技術路線2、細胞破碎3、酶的提取4、酶的分離方法GoGoGoGo5、酶的組合分離純化策略Go6、酶的濃縮、干燥與結晶Go酶的分離純化酶的提取與分離純化指將酶從細胞或其它含酶原料中提取出來，再與雜質分開，而獲得所要求的酶制品的過程。

酶的提取、分離純化技術路線細胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結晶分離等。酶的純化過程，約可分為三個階段：(1)粗蛋白質

(crudeprotein):采樣→均質打破細胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質以外的物質。(2)部分純化(partiallypurified):初步的純化，使用各種

柱層析法。(3)均質酶

(homogeneous):目標酶的進一步精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶分離純化不同階段細胞結構與酶分布細胞破碎許多酶存在于細胞內。為了提取這些胞內酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機酶的分離純化細胞破碎1.機械破碎法◆通過機械運動所產(chǎn)生的剪切力的作用，使細胞破碎的方法稱為機械破碎法?！舫Ｓ玫钠扑闄C械有組織搗碎機，細胞研磨器，勻漿器等?！魴C械破碎法分為3種:搗碎法，研磨法和勻漿法。酶的分離純化細胞破碎2.物理破碎法◆通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法，稱為物理破碎法。物理破碎法多用于微生物細胞的破碎。◆常用的物理破碎法方法有溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法：(1)溫度差破碎法：利用溫度的突然變化，由于熱脹冷縮的作用而使細胞破碎的方法稱為溫度差破碎法。酶的分離純化2.物理破碎法(2)壓力差破碎法：通過壓力的突然變化，使細胞破碎的方法稱為壓力差破碎法。常用的有高壓沖擊法、突然降壓法、及滲透壓變化法等。(3)超聲波破碎法：利用超聲波發(fā)生器所發(fā)出的聲波或超聲波的作用，使細胞膜產(chǎn)生空穴作用（cavitation）而使細胞破碎的方法稱為超聲波破碎法。酶的分離純化化學破碎法◆通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎的方法稱為化學破碎法。◆常用的化學試劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機溶劑，和曲通（Triton）、吐溫（Tween）等表面活性劑。酶的分離純化化學破碎法◆有機溶劑可以使細胞膜的磷脂結構破壞，從而改變細胞膜的透過性，使胞內酶等細胞內物質釋放到細胞外。◆表面活性劑可以和細胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使細胞膜結構破壞，從而增加細胞膜的透過性。酶的分離純化酶促破碎法◆通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎的方法稱為酶促破碎法，或稱為酶學破碎法。◆將細胞在一定的pH值和溫度條件下保溫一段時間，利用細胞本身酶系的作用，使細胞破壞，而使細胞內物質釋出的方法，稱為自溶法。酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應根據(jù)酶的結構和溶解性質，選擇適當?shù)娜軇?。一般說來，極性物質易溶于極性溶劑中，非極性物質易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質易溶于堿性溶劑中，堿性物質易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質結合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。酶的提取酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質結合牢固或含有較多非極性基團的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。酶的提取影響酶提取的主要因素影響因素主要是酶在所使用的溶劑中的溶解度以及酶向溶劑相中擴散的速度。此外，還受到溫度、pH值、提取液體積等提取條件的影響。(1)溫度：提取時的溫度對酶的提取效果有明顯影響。一般說來，適當提高溫度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的擴散速度。酶的提取影響酶提取的主要因素(2)pH值：溶液的pH值對酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著影響。為了提高酶的溶解度，提取時pH值應該避開酶的等電點。(3)提取液的體積：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是過量的提取液，會使酶的濃度降低，對進一步的分離純化不利。所以提取液的總量一般為原料體積的2～5倍，最好分幾次提取。酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、萃取分離Go1、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質分離的技術過程。沉淀分離方法分離原理

鹽析沉淀法利用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質分離等電點沉淀法利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質有不同的等電點這一特性，通過調節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離復合沉淀法在酶液中加入某些物質，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質分離酶的分離方法1、沉淀分離鹽析沉淀法◆鹽析沉淀法簡稱鹽析法，是利用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質分離的過程。在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。在蛋白質的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質的測定，所以有時也用其它中性鹽進行鹽析。在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。酶的分離方法1、沉淀分離等電點沉淀法

◆利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質有不同的等電點這一特性，通過調節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離的方法稱為等電點沉淀法?！粲捎谠诘入婞c時兩性電解質分子表面的水化膜仍然存在,在實際使用時，等電點沉淀法往往與其它方法一起使用?！粼诩铀峄蚣訅A調節(jié)pH值的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加進，以防止局部過酸或過堿而引起的酶變性失活。酶的分離方法1、沉淀分離有機溶劑沉淀法◆利用酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離的方法稱為有機溶劑沉淀法。酶的分離方法1、沉淀分離有機溶劑沉淀法常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等,有機溶劑的用量一般為酶液體積的2倍左右.有機溶劑沉淀法的分離效果受到溶液pH值的影響，一般應將酶液的pH值調節(jié)到欲分離酶的等電點附近。

有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時水的介電常數(shù)為80，而80％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。

酶的分離方法1、沉淀分離復合沉淀法◆在酶液中加入某些物質，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質分離的方法稱為復合沉淀法。◆常用的復合沉淀劑有單寧、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。酶的分離方法1、沉淀分離選擇性變性沉淀法◆選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質變性沉淀，而不影響所需的酶，這種分離方法稱為選擇性變性沉淀法?！舾鶕?jù)酶和所含雜質的特性，通過加熱或改變pH值或加進某些金屬離子等使雜蛋白變性沉淀而除去?！粼趹迷摲ㄖ?，必須對欲分離的酶以及酶液中的雜蛋白等雜質的種類，含量及其物理、化學性質有比較全面的了解。2、離心分離

離心分離是借助于離心機旋轉所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質分離的技術過程。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質以及雜質的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。酶的分離方法2.離心分離離心機的選擇◆離心機通常按照離心機的最大轉速的不同進行分類，可以分為常速（低速）離心機、高速離心機和超速離心機3種。酶的分離方法2.離心分離離心機的選擇

常速離心機（低速離心機）：最大轉速在8000r/min以內，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結晶等較大顆粒的分離。

高速離心機（設有冷凍裝置）：最大轉速為（1～2.5）×104r/min

，主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。

超速離心機：最大轉速達(2.5～12)×104r/min，主要用于DNA、RNA、蛋白質等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質量的測定等。酶的分離方法2.離心分離離心方法的選用差速離心：◆差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。密度梯度離心：◆密度梯度離心是樣品在密度梯度介質中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質分離的一種區(qū)帶分離方法。酶的分離方法2.離心分離離心方法的選用密度梯度離心◆常用的梯度介質有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其適用范圍是：蔗糖濃度5～60%，密度范圍1.02～1.30g/cm2。酶的分離方法

2.離心分離離心條件的確定離心力（或離心速度）,離心時間,溫度和pH。離心力：◆低速離心一般可以用離心速度，即轉子每分鐘的轉數(shù)表示。如5000r/min等。◆在高速離心，特別是超速離心時，往往以相對離心力（RCF）表示。如20000×g等?！粝鄬﹄x心力是指顆粒所受到的離心力與地心引力比值。

酶的分離方法

2.離心分離離心條件的確定離心時間：◆對于常速離心、高速離心和差速離心來說，離心時間是指顆粒從離心管中樣品液的液面完全沉降到離心管底的時間，稱為沉降時間或澄清時間；◆對于密度梯度離心而言，離心時間是指形成界限分明的區(qū)帶的時間，稱為區(qū)帶形成時間；酶的分離方法

2.離心分離溫度和pH值：◆離心溫度一般控制在4℃左右，對于某些耐熱性較好的酶，也可以在室溫條件下進行離心分離。◆離心介質的pH值必須是處于酶穩(wěn)定的pH值范圍內，必要時可以采用緩沖溶液。酶的分離方法3過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質將不同大小、不同形狀的物質分離的技術過程。過濾介質多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。3、過濾與膜分離過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質作為過濾介質

膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質

酶的分離方法3過濾與膜分離根據(jù)過濾介質截留的物質顆粒大小不同，過濾可以分為粗濾、微濾、超濾和反滲透等4大類。

類別截留顆粒大小截留的主要物質過濾介質粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結金屬等微濾0.2～2μm細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜酶的分離方法3過濾與膜分離根據(jù)推動力的產(chǎn)生條件不同，過濾有常壓過濾，加壓過濾，減壓過濾等3種。(1)常壓過濾:以液位差為推動力的過濾。實驗室常用的濾紙過濾以及生產(chǎn)中使用的吊籃或吊袋過濾都屬于常壓過濾。(2)加壓過濾:以壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力為推動力。生產(chǎn)中常用各式壓濾機進行加壓過濾。(3)減壓過濾:又稱為真空過濾或抽濾，是通過在過濾介質的下方抽真空的方法，以增加過濾介質上下方之間的壓力差，推動液體通過過濾介質，而把大顆粒截留的過濾方法.實驗室常用的抽濾瓶和生產(chǎn)中使用的各種真空抽濾機均屬于此類。減壓過濾需要配備有抽真空系統(tǒng)。由于壓力差最高不超過0.1MPa，多用于粘性不大的物料的過濾。酶的分離方法3過濾與膜分離非膜過濾◆采用高分子膜以外的材料,如濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結金屬等作為過濾介質的分離技術稱為非膜過濾。包括粗濾和部分微濾。酶的分離方法3過濾與膜分離非膜過濾1)粗濾：◆借助于過濾介質截留懸浮液中直徑大于2μm的大顆粒，使固形物與液體分離的技術稱為粗濾。通常所說的過濾就是指粗濾?！舸譃V主要用于分離酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、培養(yǎng)基殘渣及其它大顆粒固形物。◆粗濾所使用的過濾介質主要有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結金屬等?！魹榱思涌爝^濾速度，提高分離效果，經(jīng)常需要添加助濾劑。常用的助濾劑有硅藻土、活性炭、紙粕等。酶的分離方法3過濾與膜分離非膜過濾2)微濾:◆微濾又稱為微孔過濾。微濾介質截留的物質顆粒直徑為0.2～2μm，主要用于細菌、灰塵等光學顯微鏡可以看到的物質顆粒的分離。◆非膜微濾一般采用微孔陶瓷、燒結金屬等作為過濾介質。也可采用微濾膜為過濾介質進行膜分離。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術◆借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質顆粒或分子進行分離的技術稱為膜分離技術。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術膜分離加壓膜分離

微濾超濾反滲透電場膜分離

電滲析離子交換膜電滲析

擴散膜分離

透析酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術根據(jù)物質顆粒或分子通過薄膜的原理和推動力的不同，膜分離可以分為3大類。(1)加壓膜分離:以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動力的膜分離技術。在靜壓差的作用下，小于孔徑的物質顆粒穿過膜孔，而大于孔徑的顆粒被截留。

根據(jù)所截留的物質顆粒的大小不同，加壓膜分離可分為微濾、超濾和反滲透等3種。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術①微濾：以微濾膜（也可以用非膜材料）作為過濾介質的膜分離技術。微濾膜所截留的顆粒直徑為0.2～2μm。微濾過程所使用的操作壓力一般在0.1MPa

以下。

在實驗室和生產(chǎn)中通常利用微濾技術除去細菌等微生物，達到無菌的目的。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術②超濾：超濾又稱超過濾。是借助于超濾膜將不同大小的物質顆?；蚍肿臃蛛x的技術。超濾膜截留的顆粒直徑為20～2000?。相當于分子質量為1×103～5×105道爾頓。

主要用于分離病毒和各種生物大分子。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術③反滲透：反滲透膜的孔徑小于20?，被截留的物質分子質量小于1000道爾頓。操作壓力為0.7～13MPa

。

主要用于分離各種離子和小分子物質。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術(2)電場膜分離◆電場膜分離是在半透膜的兩側分別裝上正、負電極。在電場作用下，小分子的帶電物質或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動，透過半透膜，而達到分離的目的?！綦姖B析和離子交換膜電滲析即屬于此類。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術①電滲析：◆滲析時要控制好電壓和電流強度，滲析開始的一段時間，由于中心室溶液的的離子濃度較高，電壓可低些。當中心室的離子濃度較低時，要適當提高電壓?！綦姖B析主要用于酶液或其它溶液的脫鹽、海水淡化、純水制備以及其它帶電荷小分子的分離。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術②

離子交換膜電滲析：◆離子交換膜電滲析的裝置與一般電滲析相同。只是以離子交換膜代替一般的半透膜而組成。離子交換膜的選擇透過性比一般半透膜強。◆離子交換電滲析在酶液脫鹽、海水淡化、以及從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸等帶有電荷的小分子發(fā)酵產(chǎn)物等。酶的分離方法3過濾與膜分離膜分離技術(3)擴散膜分離◆擴散膜分離是利用小分子物質的擴散作用，不斷透過半透膜擴散到膜外。而大分子被截留，從而達到分離效果。常見的透析就是屬于擴散膜分離?！敉肝瞿た捎脛游锬?、羊皮紙、火棉膠或賽璐玢等制成。◆透析主要用于酶等生物大分子的分離純化，從中除去無機鹽等小分子物質。透析液濃縮的蛋白混合樣品

透析袋

開始透析處于平衡狀態(tài)膜技術

截留物尺寸nm（分子量）

推動力

分離機理

微濾MF>20(>40,000)壓力差，>100kPa篩分

超濾UF1～20(10,000--40,000)壓力差，>100kPa篩分

納濾NF>1(100～1000)壓力差，<1000kPa優(yōu)先吸附、表面電位

反滲透RO(>100)壓力差，>1000kPa優(yōu)先吸附、溶解擴散

四種常用膜分離技術的基本特征四種常用膜分離過程的截留特性酶的分離方法4層析分離

層析分離是利用混合液中各組分的物理化學性質（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同比例分布在兩相中。酶的分離方法4層析分離其中一個相是固定的稱為固定相，另一個相是流動的，稱為流動相。當流動相流經(jīng)固定相時，各組分以不同的速度移動，從而使不同的組分分離純化。分離純化酶采用的層析方法常用的有吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析等，

層析分離方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達到物質分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化酶的分離方法4層析分離吸附層析吸附層析是利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。酶的分離方法4層析分離吸附層析層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。酶的分離方法4層析分離吸附層析洗脫方法

①溶劑洗脫法：采用單一或者混合的溶劑進行洗脫的方法，是目前應用最廣泛的方法。

②置換洗脫法：又稱為置換法或取代法。所用的洗脫劑是置換洗脫液。③前緣洗脫法：又稱為前緣分析法，是連續(xù)向吸附層析柱內加入欲分離的混合溶液，即所用的洗脫液為含有各組分的混合溶液本身。溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法

酶的分離方法4層析分離吸附層析吸附劑與洗脫劑的選擇

極性物質容易被極性表面吸附；非極性物質容易被非極性表面吸附；溶液中溶解度越大的物質越難被吸附。無機吸附劑和有機吸附劑。吸附劑通常由一些化學性質不活潑的多孔材料制成，比表面積很大。酶的分離方法4層析分離吸附層析吸附劑與洗脫劑的選擇常用吸附劑包括：硅膠、活性炭、磷酸鈣、碳酸鹽、氧化鋁、硅藻土、泡沸石、陶土、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖、瓊脂糖、菊糖、纖維素等。此外，還可以在吸附劑上連接親和基團而制成親和吸附劑。酶的分離方法4層析分離吸附層析洗脫劑選擇◆對于極性組分，用極性大的溶劑洗脫效果較好?！舳鴮τ诜菢O性組分，則用非極性溶劑洗脫較佳?！粝疵搫┑姆N類有：飽和烴、醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等。酶的分離方法4層析分離分配層析

分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，由于不同的溶質有不同的分配系數(shù)，移動速度不同，從而達到分離。而使各組分分離的方法。分配系數(shù)是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)，以K表示。從一個混合物中分離和純化一種生物物質的純度如何，取決于混合物中各組分K值的差異程度?；旌衔镏懈鹘M分若K值相差較大,則能較易地把混合物中的生物物質分離。反之,K值相差較小,不易把混合物中的生物物質分離。紙上層析分配薄層層析分配氣相層析酶的分離方法4層析分離分配層析在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當某溶質在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。酶的分離方法4層析分離離子交換層析離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。酶的分離方法4層析分離離子交換層析離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質。通過在不溶性高分子物質（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。按活性基團的性質不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。按母體物質種類的不同，離子交換劑有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。酶的分離方法4層析分離離子交換層析由于酶分子具有兩性性質，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。在溶液的pH值大于酶的等電點時，酶分子帶負電荷，可用陰離子交換劑進行層析分離；當溶液pH值小于酶的等電點時，酶分子帶正電荷，則要采用陽離子交換劑進行分離。酶的分離方法4層析分離凝膠層析凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達到物質分離的一種層析技術。

酶的分離方法4層析分離凝膠層析凝膠層析的基本原理◆凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，各組分在層析柱內同時進行兩種不同的運動。◆一種是隨著溶液流動而進行的垂直向下的移動，另一種是無定向的分子擴散運動（布朗運動）?！舸蠓肿游镔|由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。◆較小的分子能進入凝膠的微孔內，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內外，這就使小分子物質向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子進入葡聚糖珠內大分子不能進入珠內，經(jīng)珠之間縫隙流出酶的分離方法4層析分離凝膠層析凝膠的選擇與處理：凝膠材料主要有葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等。酶的分離方法4層析分離凝膠層析凝膠的選擇與處理：葡聚糖凝膠：一般由相對分子質量4×104～20×104的葡聚糖為單體，以1，2-環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，交聯(lián)聚合而成。商品名有多種。如Sephadex

等。葡聚糖凝膠具有良好的化學穩(wěn)定性，在堿性條件下非常穩(wěn)定，在0.01mol/L的鹽酸中放置半年不受影響,可以耐受120℃甚至更高的溫度，廣泛應用于各種物質的分離純化。酶的分離方法4層析分離凝膠層析凝膠的選擇與處理：瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠：瓊脂凝膠是一種天然多孔凝膠，其內部孔徑較大，允許較大的分子進出，因此其用作凝膠層析時的工作范圍大于聚丙烯酰胺凝膠和葡聚糖凝膠。酶的分離方法4層析分離凝膠層析凝膠的選擇與處理：聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺（CH2＝CH-CONH2）與甲叉雙丙烯酰胺（CH2＝CH-CONH-CH2-NHCO-CH＝CH2）共聚而成。商品名稱有多種，如生物膠-P（Bio-gelP）等。聚丙烯酰胺是一種惰性凝膠，適合于各種酶、蛋白質、核酸等的分離純化。缺點是遇強酸時，會使其中的酰胺鍵水解而使結構破壞。一般在pH2～11的范圍內使用。酶的分離方法4層析分離凝膠層析凝膠的選擇與處理：選擇凝膠主要是依據(jù)欲分離組分的分子質量的大小。凝膠層析操作過程：凝膠層析的操作一般包括裝柱、上柱、洗脫等過程

酶的分離方法4層析分離親和層析親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術。酶的分離方法4層析分離親和層析親和層析母體和配基在親和層析中,作為固定相的一方稱為配基(Ligand).配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(Matrix)上.母體又稱為載體或擔體.在親和層析中,一般采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠或纖維素等作為母體含配體溶液收集目的蛋白

洗下未結合的蛋白混合蛋白樣品平衡液帶有配體的樹脂珠（或膠粒）酶的分離方法4層析分離親和層析親和層析方法：根據(jù)欲分離組分與配基的結合特性,親和層析可以分為:（1）共價親和層析

(2）疏水層析（3）金屬離子親和層析（4）免疫親和層析

(5)染料親和層析(6)凝集素(Lectin)親和層析5、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：

紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳

酶的分離方法6萃取分離

萃取分離是利用物質在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。按照兩相的組成不同，萃取可以分為有機溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取和反膠束萃取等。酶的分離方法有機溶劑萃取分離用于萃取的有機溶劑主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如，用丁醇萃取微粒體或線粒體中的酶；用苯酚萃取RNA等。由于有機溶劑容易引起酶蛋白和酶RNA的變性失活，所以在酶的萃取過程中，應在0－10℃的低溫條件下進行，并要盡量縮短酶與有機溶劑接觸的時間。酶的分離方法雙水相萃取雙水相萃取的兩相分別為互不相溶的兩個水相。雙水相萃取中使用的雙水相一般由按一定百分比組成的互不相溶的鹽溶液和高分子溶液或者兩種互不相溶的高分子溶液組成。在雙水相系統(tǒng)中，蛋白質、RNA等在兩相中的溶解度不一樣，分配系數(shù)不同，從而達到分離。各種雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉酶的分離方法超臨界萃取

超臨界萃取又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質與雜質在超臨界流體中的溶解度不同而達到分離的一種萃取技術。超臨界流體（supercriticalfluid,SF）是一種物質狀態(tài)，當物質在超過臨界溫度及臨界壓力以上，氣體與液體的性質會趨近于類似，最后會達成一個均勻相流體現(xiàn)象。超臨界流體類似氣體具有可壓縮性，而且又兼具有類似液體的流動性，密度一般都介于0.1到1.0g/ml之間。某些超臨界流體的超臨界點和超臨界密度流體名稱臨界溫度(℃)臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H27氨NH3132.411.280.236二氧化碳CO231.17.380.46二氧化硫SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑氣N2O51氟里昂C28.83.900.578酶的分離方法超臨界萃取CO2超臨界萃取的工藝過程由萃取和分離組成:萃取在萃取罐中進行，將原料裝入萃取罐，通入一定溫度和壓力的超臨界CO2,將欲分離的組分萃取出來。分離在分離罐中進行，是將目的物與超臨界CO2分離的過程。根據(jù)分離方法的不同，分離工藝過程可以分為3種:等壓分離、等溫分離、吸附分離酶的分離方法反膠束萃?。悍茨z束萃取是利用反膠束將酶或其他蛋白質從混合液中萃取出來的一種分離純化技術。反膠束，又稱為反膠團，是表面活性劑分散于連續(xù)有機相中形成的納米尺度的一種聚集體。反膠束溶液是透明的，熱力學穩(wěn)定的系統(tǒng)。酶的分離方法反膠束系統(tǒng)作為液—液萃取方法，更具有選擇性。其基本過程是：首先在酶蛋白相轉移最佳的條件下，將酶從水相中萃取到反膠束相中。第二步，在最佳條件下，將酶