實驗一有絲分裂標本制備

有絲分裂染色體制片及觀察一、實驗目的1.學習并掌握根尖處理、染色、壓片及制片觀察的方法。2.觀察有絲分裂各時期染色體的形態(tài)變化，了解有絲分裂全過程。二、實驗原理

高等植物有絲分裂主要發(fā)生在根尖、莖尖生長點及幼葉等器官的分生組織(分生區(qū)),其中根尖是最常用的材料：①根尖取材容易，操作和鑒定也比其它器官與組織方便；②實驗室內(nèi)采用種子萌發(fā)后所長出的新鮮幼嫩根尖，不受植物生長季節(jié)的影響和限制，并且可以大量獲得；③對于某些珍貴而又稀少的試驗材料，取用自然條件下生長植株的根尖，比取用莖尖、花器等對材料的傷害要小得多；④采用實驗室內(nèi)種子發(fā)根，切取根尖后的種苗通常還可以進行正常種植，利于后續(xù)研究進行。有絲分裂期在整個細胞周期中所占的時間相對比較短，有絲分裂制片的主要目的是進行染色體鑒定，希望觀察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要對材料進行不同的預處理。預處理：主要通過抑制和破壞紡錘絲的形成來獲得更多的中期分裂相；預處理還可改變細胞質(zhì)的粘度，促使染色體縮短和分散，便于壓片和觀察。常用的預處理有物理法、化學法、混合處理法等。植物細胞的細胞壁對細胞形態(tài)和結構起支撐和保護作用，分生組織的細胞壁結構將分生細胞結合成一個整體，因此在壓片之前需要采用適當方法軟化或部分分解細胞壁使細胞間易于分離，這一操作稱為解離。解離也可適當清除部分細胞質(zhì)，使細胞質(zhì)背景趨于透明化，便于觀察染色體。常用的解離方法主要有酸解法和酶解法。酸解法：步驟簡便、容易掌握。根尖分生組織經(jīng)過酸解和壓片后，都呈單細胞，但大部分分裂細胞的染色體還包在細胞壁中間。酸解法廣泛用于染色體計數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察及相關分析。酶解法常用于染色體顯帶技術或姊妹染色單體交換研究。通過解離和壓片，分生細胞的原生質(zhì)體能夠從細胞壁里壓出，使染色體周圍不帶有細胞質(zhì)或僅有少量細胞質(zhì)，讓后續(xù)制片處理直接作用于染色體。在普通光學顯微鏡下觀察染色體形態(tài)結構還需要對材料進行染色，通常采用染色體染色效果好而細胞質(zhì)著色少的堿性染料、酸性染料或孚爾根試劑染色。三、實驗材料

洋蔥（2n=16）根尖四、實驗試劑

0.1％秋水仙素或飽，卡諾氏固定液，醋酸洋紅染液，冰乙酸，無水乙醇，70％乙醇，１mol/L鹽酸。①水培法②砂培法五、實驗方法1.發(fā)根取材：上午10:00～11:00下午4:00～5:002.預處理

將剪下的根尖立即放入0.1％秋水仙堿水溶液中，以藥液浸沒根尖為度，處理3～4h。抑制和破壞紡錘絲的形成，使根尖細胞延遲其染色體的分離，增加中期分裂相，并使染色體分散于細胞中，以便觀察計數(shù)。3.固定①什么叫固定？為什么要固定？②固定液

乙醇:冰乙酸=3:14.保存70%的乙醇可以長期保存材料5.解離1mol/LHCl60℃水浴中解離4′±15″6.水洗7.染色及壓片①取分生組織1/3左右于載片上，解剖針碾碎，并鋪展開；②在材料上滴一滴醋酸洋紅

，染色10-15分鐘；③蓋片，用濾紙覆蓋蓋片，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動)，使材料分散壓平，便于觀察。3.固定

材料經(jīng)預處理后用流水沖洗，然后投入卡諾液(3份甲醇:1份冰乙酸，現(xiàn)配現(xiàn)用)中固定20～24h，用95％的乙醇洗兩次，轉入70％乙醇中保存?zhèn)溆谩９潭ǖ哪康氖菍⒉牧涎杆贇⑺?，并使染色體形態(tài)、結構盡可能保持不變和便于染色。4.解離

常用酸解法：從70％乙醇中取出固定好的根尖→流水沖洗3min→吸水紙吸干→放入盛有適量1mol/LHCl，60±0.5℃水浴保溫的青霉素瓶中→解離10min。5.染色

改良石炭酸品紅染色：

解離后材料水洗3min并吸干，取1/2個根尖的乳白色分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加1～2滴染液，染色10～15min，壓片。8.鏡檢

通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少數(shù)，因此壓片后要認真仔細地進行鏡檢。先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細觀察、記數(shù)或拍照。調(diào)節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗合適，視場亮度適中。注意觀察有絲分裂全過程的染色體形態(tài)變化，找出染色體分散好的中期細胞進行染色體計數(shù)，對好的分裂圖像作上標記，以便再觀察。六、結果間期：在光學顯微鏡下，只看到均勻一致的細胞核及許多的絲狀染色質(zhì)。實質(zhì)上間期的核是處于高度活躍的生理生化的代謝階段，正為細胞分裂準備條件。

前期：

核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮為細長而卷曲的染色體，每一染色體含有兩個染色單體，它們具有一個共同的著絲點；核仁和核膜逐漸模糊不明顯。中期：

核仁、核膜逐漸消失，各染色體排列在赤道板上，紡錘絲與染色體的著絲點相連。染色體分散，易于鑒定形態(tài)、數(shù)目。后期：

各染色體著絲點分裂為二，其每條染色單體也相應地分開，并各自隨著紡錘絲的收縮而移向兩極，每極有一組染色體，數(shù)目和原來的相同。

末期：分開在兩極的染色體各自組成新的細胞核，在細胞質(zhì)中央赤道板處形成新的細胞壁，使細胞分裂為二，形成二個子細胞。這時細胞進入分裂間期。

七、注意事項1.酒精和解離液都要清洗干凈，并認真吸干，否則影響染色效果。2.染色時間10分鐘是個參考時間，應以實際染色效果判斷，不太長也不能太短。3.鑷子敲打時，應用力均勻，開始不要太重，避免細