魯紅一號(hào)元寶楓葉片總RNA提取方法的比較研究

‘魯紅一號(hào)’元寶楓葉片總RNA提取方法的比較研究

郝雪英等Summary：‘魯紅一號(hào)元寶楓葉片中富含大量多糖、多酚物質(zhì)，嚴(yán)重影響了總RNA提取的產(chǎn)率和質(zhì)量。為了找出適宜‘魯紅一號(hào)元寶楓葉片總RNA提取的方法，本試驗(yàn)運(yùn)用試劑盒法、TRIZOL法和改良CTAB法提取其秋季葉片總RNA。結(jié)果表明，試劑盒法提取的葉片總RNAOD260/OD280、OD260/OD230均在1.8以上，但產(chǎn)率一般，有DNA污染；TRIZOL法提取的總RNAOD260/OD280、OD260/OD230均在1.5左右，且產(chǎn)率最低；改良CTAB法提取的總RNAOD260/OD280、OD260/OD230均在2.0左右，且產(chǎn)率最高，電泳圖較清晰。說(shuō)明采用改良CTAB法提取的葉片總RNA質(zhì)量和產(chǎn)率高，可以滿足分子生物學(xué)進(jìn)一步研究的需求，是‘魯紅一號(hào)元寶楓葉片總RNA提取的適宜方法。Key：‘魯紅一號(hào)元寶楓；總RNA提取；改良CTAB法：S792.35文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A：1001-4942（2015）03-0005-04ComparativeStudyonExtractionMethodsofTotalRNAfromLeavesofAcerTruncatum‘LuhongNo.1HaoXueying，F(xiàn)engzhen，LüChuanqing（CollegeofForestry，ShandongAgriculturalUniversity，Taian271018，China）AbstractAlargeamountofpolysaccharidesandpolyphenolsinAcertruncatum‘LuhongNo.1leaveshaveseriouslyaffectedtheyieldandqualityoftotalRNAextraction.InordertoobtaintheappropriatemethodoftotalRNAextraction，3methods，Kitmethod，TRIZOLandmodifiedCTAB，werechosentoextractthemfromAcertruncatum‘LuhongNo.1autumnleaves.TheresultsshowedthatthetotalRNAextractedbyKitmethodhadthegeneralyield，theratiosofOD260/OD280andOD260/OD230werebothabove1.8，andhadthepollutionofDNA.ThatextractedbyTRIZOLmethodhadthelowestyield，theratiosofOD260/OD280andOD260/OD230werebothabout1.5.ThatextractedbymodifiedCTABmethodshowedclearelectrophoresispatternandhighestyield，andtheratiosofOD260/OD280andOD260/OD230werebothabout2.0.TheresultsdemonstratedthattheyieldandpurityoftheRNAobtainedbythemodifiedCTABmethodcouldmeetthedemandsofmolecularbiologyexperiment.ThemodifiedCTABmethodwastheappropriatemethodfortotalRNAextractionfromAcertruncatum‘LuhongNo.1leaves.KeywordsAcertruncatum‘LuhongNo.1；TotalRNAextraction；ModifiedCTABmethod元寶楓冠大蔭濃、樹(shù)姿優(yōu)美、葉形美麗，在堤岸、湖邊、草地及建筑附近配植皆很雅致，是北方重要的秋色葉樹(shù)種。但在華北作庭蔭樹(shù)和行道樹(shù)時(shí)，多數(shù)表現(xiàn)一般，本課題組經(jīng)多年研究選育出的‘魯紅一號(hào)元寶楓，在擁有元寶楓觀賞特性的基礎(chǔ)上秋葉鮮紅，紅葉持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，觀賞價(jià)值高。近幾年來(lái)，關(guān)于元寶楓的研究報(bào)道較多，但內(nèi)容偏向于植物生理、組織培養(yǎng)等方面[1～3]，有關(guān)其分子生物學(xué)的研究報(bào)道較少。從植物中提取純度高、完整性好的總RNA是進(jìn)行各項(xiàng)分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，是研究基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。到目前為止，已有許多關(guān)于植物組織總RNA提取的研究報(bào)道[4～6]，最常用的有SDS-苯酚法[7]、改良SDS-苯酚法[8]、異硫氰酸胍法[9]、CTAB法[10]、改良熱硼酸法[11]及各種試劑盒法等。因‘魯紅一號(hào)元寶楓為彩色葉樹(shù)種，含有較多的多糖多酚物質(zhì)，因而提取高純度的RNA有一定難度，嚴(yán)重影響了元寶楓分子生物學(xué)研究。為此，本試驗(yàn)使用試劑盒法、TRIZOL法、改良CTAB法對(duì)‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片總RNA提取進(jìn)行比較研究，通過(guò)檢測(cè)分析獲得了最佳提取方法，為深入開(kāi)展元寶楓基因表達(dá)等分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，為其他彩色葉樹(shù)種的總RNA提取提供借鑒。1材料與方法1.1材料與試劑葉片采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)栽植的‘魯紅一號(hào)元寶楓，植株長(zhǎng)勢(shì)健壯，秋葉鮮紅，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。試劑盒法采用EASYspinPlus植物RNA快速提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；TRIZOL試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；改良CTAB法所需藥品均為本實(shí)驗(yàn)室配制。endprint配制改良CTAB法試劑所需要的水均經(jīng)過(guò)DEPC處理，玻璃儀器在烘箱里180℃烘10小時(shí)以上，塑料耗材先用DEPC水在37℃浸泡12小時(shí)以上，然后用滅菌鍋滅菌。1.2葉片總RNA的提取1.2.1試劑盒法稱取100mg‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片，迅速放入盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，按照試劑盒說(shuō)明提取總RNA。1.2.2TRIZOL法稱取100mg‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片，迅速放入盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，按照試劑盒說(shuō)明提取總RNA。1.2.3改良CTAB法（1）稱取100mg‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片，迅速放入盛有液氮的研缽中研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入盛有1000μL65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液[含2%CTAB、2%PVP、100mmol/LTris-HCl（pH8.0）、25mmol/LEDTA（pH8.0）、1.4mol/LNaCl]的2mL離心管內(nèi)，離心管中提前加入20μLβ-巰基乙醇，充分顛倒混勻，65℃水浴40min，每隔十分鐘混勻一次，防止樣品凝固于試管底部。（2）4℃、12000r/min離心25min。（3）取上清于新的2mL離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）充分混勻，4℃、12000r/min離心15min。重復(fù)上述步驟。（4）取上清于新的1.5mL離心管里，加入1/3體積的LiCl（8mol/L）溶液，混勻，放入4℃冰箱過(guò)夜。（5）4℃、12000r/min離心30min。（6）去掉上清液，分別用70%的乙醇和無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩次。（7）向沉淀中加入400μL65℃預(yù)熱的SSTE充分溶解沉淀后，加入400μL氯仿∶異戊醇（24∶1），充分混勻，4℃、12000r/min離心15min。（8）取上清于新的1.5mL離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇（-20℃放置）和1/10體積的NaAc（3mol/L），充分混勻，于-80℃冰箱中放置30min。（9）4℃、12000r/min離心30min。（10）去掉上清液，用70%的乙醇和無(wú)水乙醇各洗滌沉淀兩次。（11）將乙醇晾干，加入30μLDEPC處理過(guò)的超純水溶解沉淀，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。1.3RNA質(zhì)量與濃度檢測(cè)取1μLRNA樣品，用ND-2000核酸蛋白分析儀進(jìn)行含量以及純度的測(cè)定。取5μLRNA加1μL6×LoadingBuffer，在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液、10V/cm穩(wěn)壓條件下電泳15min，對(duì)RNA純度和完整性進(jìn)行檢測(cè)[12]。2結(jié)果與分析2.1總RNA的質(zhì)量與濃度3種提取方法獲得的‘魯紅一號(hào)元寶楓秋季葉片總RNA的純度及產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)表l。一般情況下，通過(guò)OD260/OD280檢測(cè)RNA的純度，高純度的RNAOD260/OD280值應(yīng)介于1.8～2.0之間，如果比值低于1.8表示含蛋白質(zhì)、多糖、多酚物質(zhì)較多，如果比值大于2.2，即表明RNA有降解。OD260/OD230值應(yīng)大于2.0，過(guò)低則表明有鹽離子污染[13]。由表1可知，試劑盒法產(chǎn)率較高；TRIZOL法產(chǎn)率最低，OD260/OD280比值為1.52，表明該方法不能有效去除總RNA中的蛋白質(zhì)、多糖多酚物質(zhì)，總RNA純度很低；改良CTAB法純度較高，OD260/OD280、OD260/OD230分別為1.98、2.07，并且產(chǎn)率也最高。2.2總RNA樣品的電泳檢測(cè)RNA樣品的電泳檢測(cè)是判斷RNA質(zhì)量的重要手段之一，從膠上18S和28SrRNA的完整性可判斷RNA有無(wú)降解以及降解程度，同時(shí)可判斷有無(wú)DNA、蛋白質(zhì)污染。3種方法提取的總RNA經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳得到以下圖片（圖1），結(jié)果表明，試劑盒法和改良CTAB法提取的總RNA18S和28S條帶清晰，且28S亮度約是18S的兩倍，但試劑盒法提取的總RNA有降解現(xiàn)象且有嚴(yán)重的DNA污染（圖1A、1C）；TRIZOL法提取的總RNA18S和28S條帶不清晰，且亮度過(guò)弱，似有降解的跡象（圖1B）。3結(jié)論與討論高質(zhì)量的RNA是分子生物學(xué)試驗(yàn)成功的最關(guān)鍵因素。許多研究表明，從植物的不同品種、不同器官及組織中提取高質(zhì)量的RNA難度各不相同，這主要是與植物細(xì)胞中含有的一些成分有關(guān)，例如酚類物質(zhì)、多糖、次級(jí)代謝產(chǎn)物以及RNase等。在大多數(shù)植物中，尤其是彩色葉植物，都含有大量多糖多酚物質(zhì)?！敿t一號(hào)元寶楓與其他彩色葉植物相比，其植株體內(nèi)的多糖、多酚類物質(zhì)的含量較高，這兩種物質(zhì)的存在嚴(yán)重影響了RNA提取的質(zhì)量與產(chǎn)率，因此有效地去除多糖多酚類物質(zhì)是成功地提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。在植物細(xì)胞中，多糖和酚類物質(zhì)與核酸在空間上是相互分離的，但對(duì)組織進(jìn)行研磨破碎后，它們會(huì)與RNA相互作用，影響RNA的提取及后續(xù)反應(yīng)[14]。多糖的多數(shù)理化性質(zhì)與核糖核酸極其相似，很容易在去除多糖的同時(shí)降低RNA的產(chǎn)量；此外多糖可抑制酶的活性，被多糖污染了的RNA樣品就無(wú)法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。而殘留在樣品中酚類物質(zhì)隨著氧化程度的增加顏色會(huì)變成深褐色，被氧化的酚類化合物能穩(wěn)定地與RNA結(jié)合，導(dǎo)致RNA降解。在前人研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)運(yùn)用改良CTAB法提取的元寶楓葉片總RNA質(zhì)量最好，有效地抑制了葉片總RNA提取過(guò)程中多糖、多酚等代謝產(chǎn)物的干擾。其原因主要有：（1）較高濃度的CTAB不僅能對(duì)植物細(xì)胞有較好的裂解作用，而且能有效地分離核蛋白與核酸的復(fù)合物，同時(shí)和巰基乙醇共同作用變性蛋白、抑制RNase的活性；（2）CTAB提取緩沖液提前預(yù)熱，有效縮短了植物材料水浴的時(shí)間，降低了RNA的降解概率；（3）CTAB提取緩沖液中加入PVP以及在提取過(guò)程中加入高濃度的NaCl能有效抑制酚類的氧化及未氧化的酚類，有力地防止多糖的污染；（4）試驗(yàn)過(guò)程中加入高濃度的LiCl可去除部分多糖。上述試劑增強(qiáng)了‘魯紅一號(hào)元寶楓植物組織的裂解能力，且為反應(yīng)提供了有利的還原條件，抑制了多酚的氧化，去除多糖和蛋白的效果較好，并在試驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制RNA酶對(duì)RNA的降解作用，因此該方法提取的總RNA產(chǎn)量與純度與其他方法相比均較高，可用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。endprintReference：[1]楊科家，豐震，朱紅梅，等.元寶楓葉片花色素苷的提取及其穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（24）：334-337.[2]梁娟，藺銀鼎.元寶楓秋葉著色生理指標(biāo)的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（1）：37-40.[3]李艷菊，陶加洪，王蘭珍，等.元寶楓組織培養(yǎng)研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（3）：104-107.[4]MullinAE，SoukatchevaG，VerchereCB，etal.Applicationofinsituductalperfusiontofacilitateisolationofhigh-qualityRNAfrommousepancreas[J].Biotechniques，2006，40（5）：617-621.[5]ScottJR，ClarkCW，DeahlKL，etal.IsolationoffunctionalRNAfromperidermtissueofpotatotubersandsweetpotatostorageroots[J].PlantMolecularBiologyReporter，1998，16（1）：3-8.[6]董占強(qiáng)，翟曉巧，范國(guó)強(qiáng)，等.泡桐葉片RNA提取方法的研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，43（1）：40-43.[7]VanDriesscheE，BecckmanssS，DejaegereR，etal.Theantioxidantofchoiceforthepurificationofproteinfromphenol-richtissues[J].Anal.Biochem.，1984，141：184-188.[8]王暑輝，徐倩，徐筱，等.富含多糖多酚的側(cè)柏葉片總RNA提取方法[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（1）：76-80，89.[9]ChomczynskiP，SacchiN.Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniu