DB51-T 2964-2022口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

ICS65.020CCSB16

DB51四 川 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB51/T2964—2022口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范Technicalstandardformonitoringthepinewoodnematodeatports20222022122720230201四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言 II1范圍 12規(guī)性用件 13術(shù)和義 14監(jiān)范圍 35應(yīng)監(jiān)的物其品 36制監(jiān)計(jì)及施案 37監(jiān)方法 38實(shí)室測(cè) 49監(jiān)樣的存處理 610測(cè)果理 6附A（料附）材蟲(chóng)關(guān)7附C（料附）材蟲(chóng)介及特征 11附附C（料附）材蟲(chóng)介及特征 11附D（料附）材蟲(chóng)其似種 17附E（范附）異PCR定法 26附F（范附）時(shí)光PCR定法 28附G（范附）DNA形碼 30參考獻(xiàn) 32前 言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。麗華、宿白玉、劉國(guó)瑛、張軍、劉俊。本文件為首次發(fā)布?？诎端刹木€蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范范圍（GB/T23476-2009松材線蟲(chóng)病檢疫技術(shù)規(guī)程GB/T23478松材線蟲(chóng)普查監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程SN/T1132-2002松材線蟲(chóng)檢疫鑒定方法SN/T2757植物線蟲(chóng)檢測(cè)規(guī)范SN/T4350-2015旅客攜帶物和郵寄物檢疫鑒定和處理程序3術(shù)語(yǔ)和定義SN/T2757植物線蟲(chóng)檢測(cè)規(guī)范SN/T4350-2015旅客攜帶物和郵寄物檢疫鑒定和處理程序3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1口岸port是國(guó)家批準(zhǔn)對(duì)外開(kāi)放，允許人員、貨物、交通工具、寄遞物等進(jìn)出國(guó)境的地方。3.2松材線蟲(chóng)pinewoodnematode學(xué)名：Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle,1970habddaTenchnapheenhodeapheenhoddae寄生滑刃亞科（Parasitaphelenchinae），傘滑刃屬（Bursaphelenchus），能引起松樹(shù)萎蔫病，是針葉樹(shù)A。3.3媒介昆蟲(chóng)intermediaryinsect能攜帶松材線蟲(chóng)并能將松材線蟲(chóng)傳遞給寄主樹(shù)木的天牛。在自然條件下，松材線蟲(chóng)需依靠墨天牛屬（Monochamus）的天牛實(shí)現(xiàn)近距離傳播。3.4松褐天牛MonochamusalternatusHope,1843又名松墨天牛、松天牛，屬于天?？疲–erambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是為害松樹(shù)的一種蛀干性昆蟲(chóng)，為傳播松材線蟲(chóng)的主要媒介天牛。3.5云杉花墨天牛MonochamussaltuariusGebler,1830又名云杉花黑天牛，屬于天?？疲–erambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是一種蛀干性昆蟲(chóng)，是松材線蟲(chóng)病的傳播媒介昆蟲(chóng)。3.6木材wood帶皮或不帶皮的原木、鋸木、木板、木片等。3.7原木rawwoods未經(jīng)過(guò)干燥、化學(xué)防腐劑等處理，并未永久改變其特性的木材。3.8松木及其制品pinewoodandwoodenware指松科木材和由松科木材為原料制作的產(chǎn)品，包括松木木質(zhì)包裝材料。經(jīng)人工合成或經(jīng)加熱、加壓等深度加工的木質(zhì)材料（如膠合板、纖維板等）除外。3.9木質(zhì)包裝材料woodpackingmaterials用于承載、包裝、鋪墊、支撐、加固貨物的木質(zhì)材料，如木板箱、木條箱、木托盤(pán)、木框、木桶、木軸、木楔、墊木、枕木、襯木等。3.10疫木diseasedwood感染松材線蟲(chóng)病的寄主植物及其制品，主要為松屬植物及其制品。3.11藍(lán)變blue-stain3.12海關(guān)指定監(jiān)管場(chǎng)地customsdesignatedsupervisionsite場(chǎng)地3.13海關(guān)監(jiān)管貨物cargoundercustomssupervision3.14誘捕器監(jiān)測(cè)trapmonitoring利用人工合成引誘劑來(lái)捕獲松墨天牛，并檢查其體內(nèi)、體表是否攜帶松材線蟲(chóng)的一種監(jiān)測(cè)方法。3.15松墨天牛引誘劑pinesawyerattractant對(duì)松墨天牛成蟲(chóng)具有引誘活性的揮發(fā)性化合物，如萜烯類(lèi)等特異性植物源物質(zhì)、昆蟲(chóng)源信息素等，需與松墨天牛誘捕器配合使用。（場(chǎng)地A.6SN/T1724-2006中6.26.3SN/T4350-201556B.1m～100mGB/T23478誘捕時(shí)間一般為每年的4月下旬至10月底（不同地區(qū)有差異），即松墨天牛成蟲(chóng)羽化初期開(kāi)始，直至當(dāng)年成蟲(chóng)羽化完畢為宜?？筛鶕?jù)監(jiān)測(cè)需要選用商品化的高效引誘劑。1d～5d1.5m～2.010d～15d1誘捕器每隔3d～5d檢查一次，及時(shí)收集并清理誘捕器中的媒介天牛，并在當(dāng)日送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。詳細(xì)記錄相關(guān)信息，填寫(xiě)附錄表B.2。23476-2009C20℃～30h～24h0c（10m（10X～20X，2h鏡檢100μL～200（1050μL左右為宜。在酒精燈上以1s左右的頻率通過(guò)8次10202014011100/（a）、體長(zhǎng)/（c）/（c’）20SN/T2757按照SN/T1132-2002中附錄C.2相關(guān)內(nèi)容執(zhí)行。按照SN/T1724-2006中附錄B執(zhí)行?；騊CRPCR或DNAPCRPCRDNASN/T1132-2002中第D松材線蟲(chóng)特異PCR檢測(cè)見(jiàn)附錄E，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)見(jiàn)附錄F，DNA條形碼鑒定見(jiàn)附錄G。8.5.2分子生物學(xué)檢測(cè)依據(jù)附錄E～附錄G相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行判定，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的可鑒定為松材線蟲(chóng)。復(fù)核CNAS4（應(yīng)（）（（56℃30min）3附錄A（）松材線蟲(chóng)最早于1929年從美國(guó)德克薩斯州的長(zhǎng)葉松（Pinuspalustris）木材中分離到，被描述為AphelenchoidesxylophilusSteiner&190519711972Bursaphelenchuslignicolus1981Bursaphelenchusxylophilus（Steiner&Buhrer，1934）Nickle，1970。（20我國(guó)1982202067341871375.30112.481998年，葡萄牙海岸松發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)，這是歐盟境內(nèi)首次報(bào)道該病。2009年，西班牙發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)。美國(guó)、加拿大、墨西哥、日本、韓國(guó)、西班牙、葡萄牙、中國(guó)。松材線蟲(chóng)通過(guò)墨天牛屬（Monochamus）4d～5（M.alternatus）（M.saltuarius），（M.carolinensis），（M.galloprovincialis）122（J3與4（J1至J4），在4J3J4齡幼蟲(chóng)JIV（）J4。寄主（Pinusspp.）（P.massoniana）、黑（P.（P.（Abies（Picea（P.canadensis）（P.pungens）（Larixeuropaea）（L.（Cedrus（C.松屬以外的寄主很少在感染松材線蟲(chóng)后死亡。目前僅美國(guó)報(bào)道藍(lán)杉（Piceapungens）（Pseudotsugamenziesii）感染松材線蟲(chóng)后死亡。2μm。1μm的占77%（其中圓尾型占44%），超過(guò)1μm（1.46μm～3.41μm）的占23%。2005年，趙文霞等報(bào)道，4.2151.7μm，最長(zhǎng)達(dá)2.9μm。但該線蟲(chóng)經(jīng)灰葡萄孢培養(yǎng)后，所有雌蟲(chóng)尾均寬圓，無(wú)尾2009μm～1.2μm，較本文的群體更短。2011年，顧建鋒等報(bào)道了一種美國(guó)木質(zhì)包裝中截獲的松材μm～1μm1μm～2μm10%的雌蟲(chóng)尾尖突為μm～2.4μm，其余雌蟲(chóng)則無(wú)尾尖突或小于0.5μm。2020年，顧建鋒等從遼寧紅松分離2～31.8μm(0.3μm～3.2μm由此可見(jiàn)，無(wú)論是國(guó)內(nèi)外松材線蟲(chóng)群體，都有不少關(guān)于雌蟲(chóng)尾尖突變異的報(bào)道。2μm的情況是比較罕見(jiàn)的，從實(shí)驗(yàn)室對(duì)上千批次松材12μm附錄B（規(guī)范性附錄）口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)記錄表表B.1～B.2給出了口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)情況記錄表。表B.1口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)抽樣記錄表時(shí)間口岸樣品編號(hào)樣品來(lái)源報(bào)關(guān)單號(hào)或郵件號(hào)來(lái)源渠道樣品類(lèi)型抽樣場(chǎng)所外部癥狀取樣部位有無(wú)天牛危害有無(wú)藍(lán)變是否發(fā)現(xiàn)活蟲(chóng)及采取的措施取樣數(shù)量備注【口岸】填寫(xiě)抽樣所在地口岸具體名稱(chēng)；【樣品編號(hào)】填寫(xiě)“關(guān)區(qū)代碼+日期+2位流水號(hào)”，確保唯一性和可溯源性；【樣品來(lái)源】填寫(xiě)樣品來(lái)自哪個(gè)國(guó)家或地區(qū)；【來(lái)源渠道】填寫(xiě)貿(mào)易渠道、非貿(mào)易渠道；【口岸】填寫(xiě)抽樣所在地口岸具體名稱(chēng)；【樣品編號(hào)】填寫(xiě)“關(guān)區(qū)代碼+日期+2位流水號(hào)”，確保唯一性和可溯源性；【樣品來(lái)源】填寫(xiě)樣品來(lái)自哪個(gè)國(guó)家或地區(qū)；【來(lái)源渠道】填寫(xiě)貿(mào)易渠道、非貿(mào)易渠道；【樣品類(lèi)型】填寫(xiě)貨物、木質(zhì)包裝、旅客攜帶物、郵遞物等；【抽樣場(chǎng)所】填寫(xiě)查驗(yàn)場(chǎng)所、快件中心、監(jiān)管作業(yè)場(chǎng)所、貨物堆放場(chǎng)所、檢疫處理場(chǎng)所等；【外部癥狀】依據(jù)抽樣對(duì)象具體描述；【取樣部位】依據(jù)抽樣對(duì)象具體描述；【有無(wú)天牛危害】填寫(xiě)是或否；【有無(wú)藍(lán)變】填寫(xiě)是或否；【備注】對(duì)上述內(nèi)容信息進(jìn)行必要補(bǔ)充。表B.2口岸松材線蟲(chóng)誘捕監(jiān)測(cè)記錄表口岸：注：【誘捕器編號(hào)】填寫(xiě)“關(guān)區(qū)代碼+場(chǎng)所代碼+2位流水號(hào)”，確保唯一性和可溯源性；【檢查時(shí)間】具體到年月日；【監(jiān)測(cè)地點(diǎn)】填寫(xiě)具體地點(diǎn)信息,如貨物堆放場(chǎng)所、檢疫處理場(chǎng)所或周邊區(qū)域等；【地理坐標(biāo)】填寫(xiě)具體經(jīng)緯度。誘捕器編號(hào)檢查時(shí)間監(jiān)測(cè)地點(diǎn)地理坐標(biāo)捕獲天牛數(shù)量誘劑添加/更換情況監(jiān)測(cè)點(diǎn)是否變更檢查人附錄C（資料性附錄）松材線蟲(chóng)組介紹及鑒定特征15——松材線蟲(chóng)B.xylophilus（Steiner&Buhrer，1934）Nickle，1970——偽傘滑刃線蟲(chóng)B.fraudulentusRühm，1956（J.B.Goodey，1960）——擬松材線蟲(chóng)B.mucronatusMamiya&Enda，1979——錐尾傘滑刃線蟲(chóng)B.conicaudatusKanzaki，Tsuda&Futai，2000——鮑嘉傘滑刃線蟲(chóng)B.baujardiWaliaNegi，Bajaj&Kalia，2003——灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)B.luxuriosaeKanzaki&Futai，2003——豆傘滑刃線蟲(chóng)B.douiBraasch，Gu，Burgermeister&Zhang，2004——新加坡傘滑刃線蟲(chóng)B.singaporensisGu，Zhang，Braasch&Burgermeister，2005——大尖尾傘滑刃線蟲(chóng)B.macromucronatusGu，Zheng，Braasch&Burgermeister，2008——楊傘滑刃線蟲(chóng)B.populiTomalak&Filipiak，2010——擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)B.paraluxuriosaeGu,Wang,Braasch,2012——日本冷杉傘滑刃線蟲(chóng)B.firmaeKanzaki,Maehara,Aikawa&Matsumato,2012——韓國(guó)傘滑刃線蟲(chóng)B.koreanusGu,Wang&Chen,2013——吉拉尼傘滑刃線蟲(chóng)B.gillaniiSch?nfeld,Braasch,Riedel&Gu,2013——錦天牛屬傘滑刃線蟲(chóng)B.acaloleptaeKanzaki,Ekino,Maehara,Aikawa&Giblin-Davis,2019（）；個(gè)，P4明顯，P3和P4（圖C.1）（表C.1，表C.2）。注：A.側(cè)線和雄蟲(chóng)尾乳突排列；B.雄蟲(chóng)尾乳突排列；C.交合刺形態(tài)；D.雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋；P1～P4.尾乳突。圖C.1典型的松材線蟲(chóng)組線蟲(chóng)的特征表C.1松材線蟲(chóng)組雄蟲(chóng)交合刺和雌蟲(chóng)尾形特征圖種類(lèi)交合刺雌蟲(chóng)尾松材線蟲(chóng)（圓尾型）偽傘滑刃線蟲(chóng)擬松材線蟲(chóng)（歐洲亞種）擬松材線蟲(chóng)（東亞亞種）錐尾傘滑刃線蟲(chóng)鮑嘉傘滑刃線蟲(chóng)灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)種類(lèi)交合刺雌蟲(chóng)尾豆傘滑刃線蟲(chóng)新加坡傘滑刃線蟲(chóng)大尖尾傘滑刃線蟲(chóng)楊傘滑刃線蟲(chóng)日本冷杉傘滑刃線蟲(chóng)韓國(guó)傘滑刃線蟲(chóng)吉拉尼傘滑刃線蟲(chóng)錦天牛屬傘滑刃線蟲(chóng)表C.2松材線蟲(chóng)組雌蟲(chóng)尾形顯微特征圖種類(lèi)雌蟲(chóng)尾1雌蟲(chóng)尾2松材線蟲(chóng)（圓尾型R型）偽傘滑刃線蟲(chóng)擬松材線蟲(chóng)歐洲亞種擬松材線蟲(chóng)東亞亞種錐尾傘滑刃線蟲(chóng)擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)豆傘滑刃線蟲(chóng)新加坡傘滑刃線蟲(chóng)種類(lèi)雌蟲(chóng)尾1雌蟲(chóng)尾2大尖尾傘滑刃線蟲(chóng)楊傘滑刃線蟲(chóng)韓國(guó)傘滑刃線蟲(chóng)吉拉尼傘滑刃線蟲(chóng)錦天牛屬傘滑刃線蟲(chóng)附錄D（資料性附錄）松材線蟲(chóng)及其近似種顯微特征圖D.1～圖D.9給出了松材線蟲(chóng)及其近似種的顯微特征照片。注：A.頭部；B.陰門(mén)區(qū)（有陰門(mén)蓋）；C～F.雄蟲(chóng)尾部及交合刺；G～K.雌蟲(chóng)尾部（通常尾端鈍圓，無(wú)尾尖突；有時(shí)一些個(gè)體有尾尖突，但不超過(guò)2μm）。圖D.1典型的松材線蟲(chóng)雌雄蟲(chóng)照片(標(biāo)尺=10μm)注：A.持久型幼蟲(chóng)；B.繁殖型幼蟲(chóng)；C.雌蟲(chóng)；D.雄蟲(chóng)；E.繁殖型幼蟲(chóng)體前端；F.雌蟲(chóng)陰門(mén)區(qū)；G.繁殖型幼蟲(chóng)尾部；H.雌蟲(chóng)尾部；I.雄蟲(chóng)尾部。圖D.2不同發(fā)育階段松材線蟲(chóng)形態(tài)圖(標(biāo)尺=10μm)注：A.頭部；B.生殖原基；C-I.尾部。圖D.3松材線蟲(chóng)持久型幼蟲(chóng)頭部和尾部顯微特征圖(標(biāo)尺=10μm)注：23%，其余絕大部分均有或長(zhǎng)或短的尾尖突，末端鈍圓或銳尖，長(zhǎng)1.8μm±0.7μm0.3μm～3.2μm)。但經(jīng)灰葡萄孢人工培養(yǎng)后，所有的雌蟲(chóng)尾端鈍圓，均無(wú)尾尖突。A～N.直接從紅松樣品分離到的松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)尾形；O.圖D.4遼寧紅松中分離到的松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)尾尖形態(tài)圖(標(biāo)尺=10μm)注：A.體前部；B.中食道球區(qū)；C、E.雄蟲(chóng)尾部；D.雌蟲(chóng)陰門(mén)區(qū)；F～I(xiàn).雌蟲(chóng)尾部。松材線蟲(chóng)M型株系雌蟲(chóng)具有長(zhǎng)約2.2μm～3.0μm的尾尖突，且經(jīng)人工培養(yǎng)后仍如此。而松材線蟲(chóng)R型株系盡管有些個(gè)體會(huì)有短尾尖突，甚至有些群體大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培養(yǎng)后消失。目前M型松材線蟲(chóng)僅分布于北美，其寄主主要是冷杉屬，因此，口岸檢疫時(shí)發(fā)現(xiàn)M型松材線蟲(chóng)的頻次極低，必要時(shí)需通過(guò)分子生物學(xué)方法核實(shí)。圖D.5松材線蟲(chóng)M型株系(標(biāo)尺=10μm)圖D.6擬松材線蟲(chóng)東亞亞種（上面4幅）和歐洲亞種（下面4幅）雌蟲(chóng)尾形圖(標(biāo)尺10μm)注：A.頭部；B.交合傘及尾乳突；C-D、F-G、J-K.雌蟲(chóng)尾部；E、I.雄蟲(chóng)尾部及交合刺；H.陰門(mén)及陰門(mén)蓋。圖D.7偽傘滑刃線蟲(chóng)（B.fraudulentus）(標(biāo)尺=10μm)IJ注：IJ注：A-B.陰門(mén)；C.交合刺；D.交合傘；E-H.培養(yǎng)后雌蟲(chóng)尾部；I-L.原木中分離到的雌蟲(chóng)尾部圖D.8豆傘滑刃線蟲(chóng)新種雄蟲(chóng)顯微照片(標(biāo)尺=10μm)ABCABCDEFGHKLEFGHKL注：A、B.頭部；C.雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋；D.雌蟲(chóng)陰門(mén)至尾末端；E-F.培養(yǎng)后的雌蟲(chóng)尾部形態(tài)；G.木質(zhì)包裝中直接分離的雌蟲(chóng)尾部；H.雄蟲(chóng)交合傘；I,J.雄蟲(chóng)交合刺。圖D.9楊傘滑刃線蟲(chóng)光學(xué)顯微照片(標(biāo)尺=10μm)附錄E（）PCR試劑10PRBuer（g2+、aqMseMdH。DNA方法方法將1ddH2O200μLPCR含8μLddH2O1μL10×PCRBuffer（Mg2+free））1（），85℃加熱2minPCR1μL1mg/mL蛋白酶K，56℃15min，95℃加熱10minDNADNAPCR或者于-20℃）。特異PCR引物序列見(jiàn)表E.1。表E.1引物序列E.2.2.2特異PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及參數(shù)PCRE.2X-F/X-R℃4℃30℃特異PCR引物序列見(jiàn)表E.1。表E.1引物序列E.2.2.2特異PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及參數(shù)PCRE.2X-F/X-R℃4℃30℃30℃1min，35725J10-1和J10-2Rc945min；9430sec，641min，72℃1min，35725。引物名稱(chēng)堿基序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度X-F5’-ACGATGATGCGATTGGTG-3’約560bpX-R5’-TATTGGTCGCGGAACAAACC-3’J10-15’-GGTGTCTAGTATAATATCAGAG-3’約160bpJ10-2Rc5’-GTGAATTAGTGACGACGGAGTG-3’表E.2PCR試劑名稱(chēng)加樣量μL2×TaqMasterMix預(yù)混液25正向引物（濃度10μmol/L）2反向引物（濃度10μmol/L）2DNA模板2ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)總體積至50μL以松材線蟲(chóng)DNA模板作為陽(yáng)性對(duì)照，以不含松材線蟲(chóng)的DNA模板作為陰性對(duì)照，以ddH2O作為空白對(duì)照。配制GelRed（0.55μLPCR100bpDNAMarker3V/cm～5V/cm0.5h在陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照正確的前提下，經(jīng)瓊脂糖電泳：采用X-F/X-R引物對(duì)擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)得到與陽(yáng)性對(duì)照一致的560bp左右大小的特有條帶，或采用J10-1/J10-2Rc引物對(duì)得到160bp左右大小的特有條帶，判定結(jié)果為陽(yáng)性；否則判定結(jié)果為陰性。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和（或）空白對(duì)照不正確，無(wú)論待測(cè)樣品結(jié)果如何，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。附錄F（）PCR試劑10×PCRBuffer（Mg2+free）、蛋白酶K、2×TaqMasterMix預(yù)混液、ddH2O。DNA操作方法見(jiàn)附錄E.2.1PCR引物及探針序列見(jiàn)表F.1。F.2.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及參數(shù)3F.2.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及參數(shù)33DNADNADNADNAPCRF.2表F.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)參數(shù)：95℃10min；95℃15sec，60℃45sec，共40個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR反應(yīng)管熒光信號(hào)的收集條件應(yīng)與探針的熒光基團(tuán)一致，具體設(shè)置方法參照相應(yīng)熒光PCR儀的使用說(shuō)明。F.2.3結(jié)果判定引物名稱(chēng)堿基序列正向引物BsatF5’-TGACGGAGTGAATTGACAAGACA-3’反向引物BSatRV5’-AAGCTGAAACTTGCCATGCTAAA-3’探針BSatS5’-FAM-ACACCATTCGAAAGCTAATCGCCTGAGA-TAMRA-3’注：探針5’端含有FAM基團(tuán)的熒光染料，3’端含有TAMRA基團(tuán)的熒光染料。試劑名稱(chēng)加樣量μL2×TaqMasterMix預(yù)混液25引物BsatF（濃度10μmol/L）2引物BSatRV（濃度10μmol/L）2探針BSatS（10μmol/L）1DNA模板2ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)總體積至50μLPCR5～15值=40在陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照正確的前提下：——如果待測(cè)樣品的Ct值等于40時(shí)，則判定結(jié)果為陰性；——如果待測(cè)樣品的Ct值小于或等于35時(shí)，則判定結(jié)果為陽(yáng)性；Ct4035Ct40Ct35Ct4035附錄G（DNA試劑10×PCRBuffer（Mg2+free)、蛋白酶K、2×TaqMasterMix預(yù)混液、ddH2O。DNA操作方法見(jiàn)E.2.128S引物序列見(jiàn)表G.1。表G.1引物序列引物名稱(chēng)堿基序列擴(kuò)增片段D2A5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′約800bpD3B5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′G.2.2.2G.2.2.2PCRPCR反應(yīng)體系參見(jiàn)附錄表E.2。反應(yīng)參數(shù)94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，37個(gè)循環(huán)；72℃8min。操作方法見(jiàn)附錄E.2.3。該引物正常的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為800bp左右，若樣品PCR擴(kuò)增獲得正常產(chǎn)物，可送擴(kuò)增產(chǎn)物到生物測(cè)序公司雙向測(cè)序（可要求公司進(jìn)行拼接），建議每個(gè)樣品做3個(gè)以上重復(fù)。G.3DNAG.3.1序列拼接使用Chormas軟件或其他序列分析軟件，對(duì)28S基因測(cè)序得到的雙向峰圖文件（后綴名.ab）進(jìn)行拼接。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，去除測(cè)序結(jié)果兩端峰形雜亂的低質(zhì)量序列，并去除引物所在序列區(qū)域，獲得相應(yīng)的DNA序列。拼接完成后，DNA序列方向應(yīng)與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致并保證序列長(zhǎng)度大于740bp。G.3.2序列比對(duì)登陸NCBI網(wǎng)站中的BLAST（basic local alignment search tool）頁(yè)面（/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)。在BasicBLAST中選擇nucleotideblast，在EnterQuerySequence（Per.Ident）。在BLAST結(jié)果中查看序列相似性最高的物種，一般為與查詢(xún)序列最接近的物種。G.4結(jié)果判定若待測(cè)樣品序列與已知的松材線蟲(chóng)序列（AY508107.1、EF446929.1-EF446933.1、EF446935.1、FJ768948.1EU295491.1、DQ364687.1、DQ356002.1、EU295503.1、AY508108.1、AY508105.1、MN270176.1、MW012949.1、AM396580.1等）相似性（Per.Ident值）達(dá)98.98%以上，與其他種類(lèi)的相似性小于98.73%，可判定為松材線蟲(chóng)陽(yáng)性。若待測(cè)樣品序列與已知的松材線蟲(chóng)相似性低于98.98%，則可能不是松材線蟲(chóng)。如BLAST結(jié)果所顯示的線蟲(chóng)不是傘滑刃屬線蟲(chóng)，甚至不是線蟲(chóng)，很可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于操作不當(dāng)引入的其他微生物污染和樣品交叉污染，須重復(fù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。參考文獻(xiàn),[M].,2011.劉偉.[J].,1995,10(2):223-225.夏永剛,王明旭,張玉榮,等.[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009.,[J].,2005,18(3):362-363.鄭煒,,等[J].,2007(03):38-40.BraaschH,BurgermeisterW,GuJ.RevisedintragenericgroupingofBursaphelenchusFuchs,1937(Nematoda:Aphelench