催化反應動力學別構(gòu)反應

催化反應動力學別構(gòu)反應第一頁，共六十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)單底物反應動力學第三節(jié)多底物反應動力學第四節(jié)別構(gòu)酶動力學第五節(jié)pH和溫度對酶催化反應速度的影響主要內(nèi)容第四章酶催化反應動力學第二頁，共六十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)別構(gòu)酶反應動力學酶與一般催化劑不同的特點：可調(diào)節(jié)性；30%酶動力學不符合米氏方程，大多是寡聚酶，受代謝物調(diào)節(jié)，但代謝物結(jié)構(gòu)不類似于被調(diào)節(jié)酶底物；60年代，Jacob與Monod提出別構(gòu)理論，反饋調(diào)節(jié)作用稱為別構(gòu)效應。非唯一調(diào)節(jié)方式，卻是較為重要的一類。第三頁，共六十二頁，2022年，8月28日例

子ATC酶經(jīng)過溫和的化學處理，如用對羥基汞苯甲酸（PCMB）處理可解聚為兩個催化亞基（為三聚體）和3個調(diào)節(jié)亞基（為二聚體）。催化亞基仍有催化活力，但不再受效應物影響，調(diào)節(jié)亞基無催化活力，但仍能結(jié)合效應物。更劇烈的處理，如用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，則催化亞基和調(diào)節(jié)亞基都各解聚成6個單體

第四頁，共六十二頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容一、配體（底物）與蛋白質(zhì)結(jié)合中協(xié)同效應(link)二、別構(gòu)酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及動力學特性(link)三、別構(gòu)效應(link)go第五頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、配體（底物）與蛋白質(zhì)結(jié)合中協(xié)同效應指蛋白質(zhì)與一個配體（底物和效應物）結(jié)合后可影響蛋白質(zhì)與另一個配體結(jié)合能力；據(jù)此分類：1，正協(xié)同效應-激活

；2，負協(xié)同效應-抑制；3，同促效應（同種協(xié)同效應,homotropiceffect）一個配體與酶結(jié)合后，引起酶分子構(gòu)象變化，從而改變后續(xù)相同配體對酶的親和力；4，異促效應（異種協(xié)同效應,heterotropiceffect）一種配體與酶結(jié)合引起另一種配體對酶親和力的改變；多數(shù)別構(gòu)酶兼有同促效應和異促效應。（一）協(xié)同效應第六頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）配體與蛋白質(zhì)結(jié)合E+SES結(jié)合常數(shù)：Kb=[ES]/[E][S],

Kb=K-1S,蛋白質(zhì)飽和分數(shù)Y：[E0]恒定下，Y對[S]作圖為一雙曲線；在穩(wěn)態(tài)下，亦是一雙曲線。此是米氏方程特性!1、與具單個結(jié)合部位的蛋白質(zhì)結(jié)合第七頁，共六十二頁，2022年，8月28日2、與具多個結(jié)合部位的蛋白質(zhì)結(jié)合最簡單情形：二聚體蛋白兩個相同配體結(jié)合位，同種正協(xié)同作用：

M2+2SM2S2結(jié)合常數(shù):

Kb=[M2S2]/[M2][S]2蛋白質(zhì)飽和分數(shù)：Y=[M2S2]/[（M2）0]=Kb[S]2/(Kb[S]2+1)Y~[S],是S形曲線第八頁，共六十二頁，2022年，8月28日Hill方程結(jié)合常數(shù)取對數(shù)：更普通地，n個相同結(jié)合位之蛋白質(zhì)通式：即為Hill方程；理想條件下Lg(Y/(1-Y))~lgS作圖；即為Hill曲線圖，線性，斜率為n，縱截矩lgKb；實驗中測定的斜率n為Hill系數(shù)h;第九頁，共六十二頁，2022年，8月28日例：血紅蛋白Hill系數(shù)多結(jié)合位蛋白與配體之間的結(jié)合研究是基于氧和血紅蛋白結(jié)合之研究；1904，Bohr,繪制了血紅蛋白與氧結(jié)合的飽和分數(shù)Y對氧分壓的圖形，是S形曲線；1909,Hill基于結(jié)合部位之間相互影響引起正協(xié)同效應來解釋此曲線；若血紅蛋白有n個亞基，總反應式：Hb+nO2Hb(O2)n在基礎(chǔ)上推導出Hill方程；做為含有4個氧結(jié)合位的血紅蛋白，其斜率應為4氧飽和度YpO2血紅蛋白S形氧合曲線第十頁，共六十二頁，2022年，8月28日雖與實驗數(shù)據(jù)有偏，但此方程很好地適合了血紅蛋白氧合曲線及其它別構(gòu)蛋白的協(xié)同過程，因此其數(shù)據(jù)處理方法即Lg(Y/(1-Y))~lgPO2作圖法（Hill作圖法）得到應用。血紅蛋白氧合具高協(xié)同性，因此極高或極低氧下只結(jié)合一個氧分子，兩端斜率為1;中間氧濃度區(qū)協(xié)同性最好大，h=2.8,但曲線斜率總不會達4這個亞基數(shù)；目前其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)已初步闡明：1960，Perutz，4個結(jié)合位血紅素完全分離，相互作用不可能，可能是亞基間作用，氧合中4個氧結(jié)合也不一樣，第一個需打開鹽鍵更多些，第4個更少，故呈S形曲線！斜率=1斜率=10氧飽和百分數(shù)Lg(Y/(1-Y))第1個O2第4個O2PO2血紅蛋白Hilll圖back第十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、別構(gòu)酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及動力學特性別構(gòu)作用：指不同于底物的物質(zhì)對酶起到激活或抑制作用；別構(gòu)酶：具不止一個配基結(jié)合位的酶，活性位外的部位可與和底物結(jié)構(gòu)完全不同的物質(zhì)結(jié)合，結(jié)合后通過構(gòu)象變化影響底物與活性位的作用從而對酶催化產(chǎn)生正或負影響；發(fā)現(xiàn)起源：反饋調(diào)節(jié)；1，50年代，Umbarger,L-蘇氨酸到L-異亮氨酸五步反應，當異亮氨酸過量則對第一步酶蘇氨酸脫水酶產(chǎn)生反饋抑制！2，Gerharf嘧啶核苷酸合成途徑中發(fā)現(xiàn)終產(chǎn)物CTP抑制第一步酶，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ACTase)。第十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日（一）別構(gòu)酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)某些酶的分子表面除活性中心外，尚有調(diào)節(jié)部位，當調(diào)節(jié)物（或稱別構(gòu)物）結(jié)合到此調(diào)節(jié)部位時，引起酶分子構(gòu)象變化，導致酶活性改變，這類酶稱為變/別構(gòu)酶。

第十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日3.6重要的酶§3.6重要的酶變構(gòu)酶與變構(gòu)調(diào)節(jié)概念

變構(gòu)酶又稱為別構(gòu)酶，指酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價結(jié)合后，引起酶的構(gòu)象的改變，進而改變酶的活性狀態(tài)，酶的這種調(diào)節(jié)作用稱為變構(gòu)調(diào)節(jié)(allostericregulation)，具有變構(gòu)調(diào)節(jié)的酶稱變構(gòu)酶(allostericenzyme)。凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為變構(gòu)劑(effector)。變構(gòu)酶多為寡聚酶，含的亞基數(shù)一般為偶數(shù)；且分子中有催化部位（結(jié)合底物）與調(diào)節(jié)部位（結(jié)合變構(gòu)劑），這兩部位可以在不同的亞基上，或者在同一亞基的兩個不同部位。

第十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日效應物（effecter）———不作用于活性中心，而是活性中心以外的部位，引起分子構(gòu)象變化，來調(diào)節(jié)酶活力。此效應物為別位效應劑(allostericeffecter)第十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶第十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日特點：①一般為寡聚酶②有別構(gòu)位和催化位③作用曲線往往為S形第十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日別構(gòu)酶結(jié)構(gòu)特性：（1）有多個亞基（2）有四級結(jié)構(gòu)（3）酶分子中除了有結(jié)合底物并催化反應的活性中心外，還有可以結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心?；钚灾行暮蛣e構(gòu)中心可能位于不同的亞基或相同的亞基的不同部位。（4）活性用于結(jié)合底物，別構(gòu)中心用于調(diào)節(jié)速度；（5）有時因物理化學作用脫敏，但正常催化活性未失，表現(xiàn)出米氏方程雙曲線動力學特征。第十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日（二）動力學特性與米氏曲線比較：注意：別構(gòu)酶往往具有S曲線特征，但反之不亦然！1米氏特征曲線2正協(xié)同S曲線3負協(xié)同曲線[S]v第十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶第二十頁，共六十二頁，2022年，8月28日S形曲線動力學特征S形曲線有利于反應速度的調(diào)節(jié)！與米氏曲線比較：因此S曲線體現(xiàn)為當?shù)孜餄舛劝l(fā)生很小變化時，別構(gòu)酶可以極大程度控制反應速度30.119vmax100%AB[S]90%v[S]10%v=81[S]90%v[S]10%v=3第二十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶變構(gòu)酶作用特點1、一般變構(gòu)酶分子上有二個以上的底物結(jié)合位點。當?shù)孜锱c一個亞基上的活性中心結(jié)合后，引起酶分子構(gòu)象的改變，使其它亞基的活性中心與底物的結(jié)合能力發(fā)生改變，或出現(xiàn)正協(xié)同效應(positivecooperativeeffect)，或出現(xiàn)負協(xié)同效應（negativecooperativeeffect）。2、正協(xié)同效應的變構(gòu)酶其速度-底物濃度曲線呈S形，即底物濃度較低時，酶活性的增加緩慢，底物濃度高到一定程度后，酶活性顯著加強，最終達到最大值Vmax。如大腸桿菌的天冬氨酸轉(zhuǎn)甲?；福ˋTCase）對底物天冬氨酸的結(jié)合表現(xiàn)為正協(xié)同效應。第二十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶3、負協(xié)同效應的變構(gòu)酶其速度-底物濃度曲線為類似雙曲線。底物濃度較低時，酶表現(xiàn)出較大活性，但底物濃度明顯增加時，其反應速度無明顯變化。如3-磷酸甘油醛脫氫酶對NAD+的結(jié)合為負協(xié)同效應，其意義在于無論細胞內(nèi)酶的底物濃度如何變化，酶始終能以一個較恒定的速度進行以滿足細胞的基本需要。第二十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶4、變構(gòu)酶除活性中心外，還存在著能與變構(gòu)劑作用的亞基或部位，稱調(diào)節(jié)亞基(或部位)。變構(gòu)劑與調(diào)節(jié)亞基以非共價鍵特異結(jié)合，可以改變調(diào)節(jié)亞基的構(gòu)象，進而改變催化亞基的構(gòu)象，從而改變酶活性。凡使酶活性增強的變構(gòu)劑稱變構(gòu)激活劑(allostericactivitor)，它能使上述S型曲線左移，飽和量的變構(gòu)激活劑可將S形曲線轉(zhuǎn)變?yōu)榫匦坞p曲線。凡使酶活性減弱的變構(gòu)劑稱變構(gòu)抑制劑(allostericinhibitor)，能使S形曲線右移。例如，ATP是磷酸果糖激酶的變構(gòu)抑制劑，而ADP、AMP為其變構(gòu)激活劑。5、由于變構(gòu)酶動力學不符合米-曼氏酶的動力學，所以當反應速度達到最大速度一半時的底物的濃度，不能用Km表示，而代之以K0.5S表示。

第二十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶正協(xié)同效應的變構(gòu)酶底物活性曲線⊙不加變構(gòu)劑⊙加變構(gòu)激活劑⊙加變構(gòu)抑制劑+-back第二十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日三、別構(gòu)效應別構(gòu)效應（allostericeffect）：調(diào)節(jié)物或效應物與酶分子上的別構(gòu)中心結(jié)合后，誘導出或穩(wěn)定住酶分子的某種構(gòu)象，使酶活性中心對底物的結(jié)合和催化作用受到影響，從而調(diào)節(jié)酶反應速度及代謝過程，此效應即為酶的別構(gòu)效應。第二十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容1、別構(gòu)效應生理調(diào)節(jié)功能;2、別構(gòu)效應的類型判斷法;3、變構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)的機理與模型.第二十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日1、別構(gòu)效應生理調(diào)節(jié)功能別構(gòu)調(diào)節(jié)是快速影響酶活的一種重要方式,通常處于代謝途徑之起點或分叉點或關(guān)鍵點、限速點；例1：天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶是起始點關(guān)鍵酶受CTP抑制和ATP激活；例2：膽固醇合成途徑中部甲羥戊二酸CoA還原酶是其限速酶，終產(chǎn)物膽固醇是其別構(gòu)調(diào)節(jié)物；第二十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日協(xié)同效應之作用正協(xié)同效應使得配體濃度在一定區(qū)間內(nèi)酶反應速度對其變化非常敏感，而在區(qū)間外不敏感；例：同時受幾種酶作用之底物參與幾個代謝途徑，底物流量分配可通過正協(xié)同效應別構(gòu)酶實現(xiàn)，如氨甲酰磷酸受天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶正協(xié)同效應合理分配產(chǎn)CTP和Arg;負協(xié)同效應提供了配體濃度變化對酶反應速度不敏感區(qū)；例：若某底物許多酶均需要，此途徑特別重要，負協(xié)同效應可使該途徑穩(wěn)定進行下去，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶對NAD+產(chǎn)生負協(xié)同效應，使之穩(wěn)定產(chǎn)生而不管其它反應對NAD+的影響。第二十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日變構(gòu)酶的動力學及變構(gòu)酶對酶反應速度的調(diào)節(jié)1.大多數(shù)變構(gòu)酶具有正協(xié)同效應（酶分子結(jié)合一分子底物或效應物后，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，這種新的構(gòu)象有利于后續(xù)分子與酶的結(jié)合，大大促進后續(xù)分子與酶的親合性），其初速度與底物濃度的關(guān)系呈S形的v-[S]曲線。當?shù)孜餄舛劝l(fā)生很小的變化時，變構(gòu)酶就極大地控制著反應速度。在正協(xié)同效應中使得酶反應速度對底物濃度的變化極為敏感。第三十頁，共六十二頁，2022年，8月28日2.另一類別構(gòu)酶具有負協(xié)同效應，其動力學曲線在表現(xiàn)上與雙曲線相似，但意義不同：具有負協(xié)同效應的酶在底物濃度較低的范圍內(nèi)酶活力上升快，但再繼續(xù)下去，底物濃度雖有較大的提高，但反應速度升高卻較小。使得酶反應速度對底物濃度的變化不敏感[s]正負v第三十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶生理意義及實例1、在正協(xié)同效應的變構(gòu)酶的S形曲線中段，底物濃度稍有降低，酶的活性明顯下降，多酶體系催化的代謝通路可因此而被關(guān)閉；反之，底物濃度稍有升高，則酶活性迅速上升，代謝通路又被打開，因此可以通過細胞內(nèi)底物濃度的變化來靈敏地控制代謝速度。2、變構(gòu)抑制劑常是代謝通路的終產(chǎn)物，變構(gòu)酶常處于代謝通路的入口，通過反饋抑制，可以及早地調(diào)節(jié)整個代謝通路，減少不必要的底物消耗。

第三十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶第三十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶

例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP轉(zhuǎn)變成ATP，當ATP過多時，通過變構(gòu)抑制劑ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多時，則可通過變構(gòu)激活劑AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的活性促進糖的分解。隨時調(diào)節(jié)ATP/ADP的水平，可以維持細胞內(nèi)能量的正常供應。

第三十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶第三十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日§3.6重要的酶第三十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日2、別構(gòu)效應的類型判斷法主要有以下3種：（1）v~[S]（2）雙倒數(shù)作圖法（3）Hill作圖法（1）作圖法第三十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日v~[S]又稱米氏作圖1,符合米氏方程的無協(xié)同效應，直角雙曲線；2,S曲線的為正協(xié)同效應；3,非直角雙曲線；SvOSvOSvO米正負[S]v第三十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日雙倒數(shù)作圖即L-B作圖法；1，無協(xié)同時直線；2，正協(xié)同上凸；3，負協(xié)同下；1/[S]1/vO1/[S]1/vO1/[S]1/vO第三十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日Hill作圖對別構(gòu)酶而言Hill方程：lg(v/(vmax-v))~lgS作圖斜率為n，縱截矩lgKs，橫截矩（lgKs)/n;v=0.5vmax時[S]0.5,有：lg[S]0.5=1/nlgK0.5S[S]0.5相當米氏方程中的KmHill作圖斜率稱:Hill系數(shù)或協(xié)同系數(shù)，h表示之，可知有：h=1米氏類型酶h1具有正協(xié)同效應的別構(gòu)酶h1具有負協(xié)同效應的別構(gòu)酶lg[S]lg(v/(vmax-v))n>1olg[S]lg(v/(vmax-v))n<1olg[S]lg(v/(vmax-v))n=1o（4-66）第四十頁，共六十二頁，2022年，8月28日E+nSESnE+nPn]['][+=SKmSVmvn

v

bnxy

KmS

n

v

Vm

-=-

=

-\logloglogKmSvVmv

n=-Hill系數(shù)第四十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日Hanes作圖法[S]

v[S]正協(xié)同負協(xié)同無協(xié)同第四十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日Eadiehofstee法v[S]v正協(xié)同負協(xié)同無協(xié)同第四十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）協(xié)同指數(shù)Koshland標準：CI（cooperativityindex）協(xié)同指數(shù)：酶分子中的結(jié)合位點被底物飽和90%和10%時底物濃度的比值。亦稱飽和比值Rs(saturationratio)Rs=81米氏類型酶Rs81具有正協(xié)同效應的別構(gòu)酶Rs81具有負協(xié)同效應的別構(gòu)酶酶與底物結(jié)合達90%飽和度時底物濃度酶與底物結(jié)合達10%飽和度時底物濃度

Rs=第四十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日協(xié)同指數(shù)推導由4-66可得：用v=0.9vmax,v=0.1vmax代入得：從而有：因而有協(xié)同指數(shù)：米氏方程CI（Rs）=81n=1正協(xié)同CI（Rs）<81n>1負協(xié)同CI（Rs）>81n<1第四十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日3、變構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)的機理與模型序變模型（KNF模型）—描述異促效應更適合齊變模型(MWC模型)—不適用于負協(xié)同第四十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日（1）MWC模型1965,同Monod,Wyman,Changeux提出，同構(gòu)模型，對稱模型，定義：（1）寡聚體(oligomer)由一定數(shù)量但數(shù)目不大亞基組成；（2）相同亞基為原體（protomer);（3）單體指完全解離的原體；如兩原體假設(shè),不同構(gòu)象狀態(tài)亞基不利作用，故全是R（松弛高活性）或T（緊密低活性），兩種構(gòu)象狀態(tài)在無配體時處于平衡,底物（配體）的結(jié)合打破此平衡，這樣就能對協(xié)同效應給解釋！第四十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日MWC模型示意圖T態(tài)(對底物親和力低)R態(tài)(對底物親和力高)+S+S第四十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日RR濃度[R0]，TT濃度[T0]；R0T0平衡常數(shù)L=[T0]/[R0]；(1)當?shù)孜锊慌cT態(tài)酶結(jié)合時:R0+SR1R1+SR2KR微觀解離常數(shù)：KR=2[S][R0]/[R1][R1]=2([S]/KR)[R0]KR=[S][R1]/2[R2][R2]=([S]2/KR2)[R0]飽和分數(shù)YS=[被底物占據(jù)的活性位]/[總活性位]則有：相應式子代入有：2提示:進行書面推導:第四十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日設(shè)α=[S]/KR2(4-76)第五十頁，共六十二頁，2022年，8月28日(2)T狀態(tài)也可和配體結(jié)合，解離常數(shù)KT：KT=2[S][T0]/[T1]KT=[S][T1]/2[T2]；一般地，n個亞基聚體，第i個配體結(jié)合時，有：KT類似；設(shè)c=KR/KT,a=[S]/KR則處于R態(tài)的酶為：T態(tài)酶亦然；配體占據(jù)總活性位飽和分數(shù)：提示:進行書面推導C第五十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日當n=2時:KT=2[S][T0]/[T1]KT=[S][T1]/2[T2](4-81)C第五十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日MWC模型解釋其協(xié)同效應是基于Rn/Tn的平衡；無配體時，L很大，趨向T態(tài)；配體濃度較高時，Rn/Tn平衡受到擾動，更多Rn從Tn生成，產(chǎn)生更多的RnS，RnS2絡(luò)合物直至Tn全部轉(zhuǎn)變成Rn,因此整個結(jié)合曲線是S型，是正協(xié)同效應特征；不能解釋同種負協(xié)同效應MWC模型第五十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）KNF模型1966年Koshland,Nemethy,Filmer提出，漸變模型；不同點：（1）無底物時不存在R0-T0的平衡,T到R是配基的誘導;（2）若由n全亞基構(gòu)成,則由T到R態(tài)不是同時進行的,存在RT狀態(tài);（3）可以是正或負協(xié)同效應;+S+STTRTRR第五十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日以二亞基酶為例，O表示T態(tài)，口表示R態(tài)，KtTR,T到R的平衡常數(shù);KSR,S與R結(jié)合的平衡常數(shù);KTR,S與T結(jié)合的絡(luò)合常數(shù);過程如下：SSKtTRKSRKTRKTTKNF模型形態(tài)與教材規(guī)定的相反!第五十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日以O(shè)O為標準態(tài),相對濃度為1,如要計算濃度則有:S+OSOKTR×OSO