薄板層析法鑒定四環(huán)素純

會(huì)計(jì)學(xué)1薄板層析法鑒定四環(huán)素純生物分離工程實(shí)驗(yàn)I基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：第11/12周薄板層析法鑒定四環(huán)素成品純度第14周PEG400/(NH4)2SO4兩水相系統(tǒng)相圖的制作第15周兩水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定第16周離子交換樹(shù)脂總交換容量的測(cè)定第1頁(yè)/共23頁(yè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及時(shí)間薄板層析法鑒定四環(huán)素純度

實(shí)驗(yàn)一班：第11周周一，周四實(shí)驗(yàn)二班：第12周周一，周四兩水相萃取相圖制作

實(shí)驗(yàn)一班：第14周周一

實(shí)驗(yàn)二班：第14周周四兩水相萃取蛋白質(zhì)分配系數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)一班：第15周周一

實(shí)驗(yàn)二班：第15周周四離子交換樹(shù)脂總交換容量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)一班：第16周周一

實(shí)驗(yàn)二班：第16周周四第2頁(yè)/共23頁(yè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排表周次日期星期時(shí)間發(fā)酵實(shí)驗(yàn)5-212分離實(shí)驗(yàn)5-112115月6日星期一13:30

實(shí)驗(yàn)一班5月9日星期四13:30

實(shí)驗(yàn)一班125月13日星期一13:30

實(shí)驗(yàn)二班5月16日星期四13:30

實(shí)驗(yàn)二班135月20日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班

5月23日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班

145月27日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班5月30日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班156月3日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班6月6日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班166月8日星期六13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班6月13日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班176月17日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班

6月20日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班

第3頁(yè)/共23頁(yè)考核方式考勤提問(wèn)和操作實(shí)驗(yàn)報(bào)告：預(yù)習(xí)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)結(jié)果、討論、思考題第4頁(yè)/共23頁(yè)薄板層析法鑒定四環(huán)素純度第5頁(yè)/共23頁(yè)加深對(duì)薄板層析法基本原理的理解。熟悉薄板層析法的操作過(guò)程。采用薄板層析法來(lái)考察四環(huán)素制品純度。一、目的和要求第6頁(yè)/共23頁(yè)（一）層析：色譜chromatography一種分離技術(shù)。任何層析都具有兩個(gè)相，固定相固定不動(dòng)，流動(dòng)相對(duì)固定相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)。不同物質(zhì)在兩相間分配差異，隨流動(dòng)相以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。固定相：固體或液體(固定在載體上)流動(dòng)相：流過(guò)固定相的液體、氣體或超臨界流體。二、實(shí)驗(yàn)原理第7頁(yè)/共23頁(yè)（二）層析方法：根據(jù)機(jī)理可以分為：分配層析吸附層析凝膠層析離子交換層析親和層析二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)層析的方式：紙層析薄層層析柱層析第8頁(yè)/共23頁(yè)（三）薄板層析（TLC）利用不同溶質(zhì)組分在固定相和流動(dòng)相的兩種液體中分配系數(shù)不同，展層時(shí)形成以不同速度移動(dòng)的區(qū)帶，達(dá)到分離。溶質(zhì)易分配在固定相中溶質(zhì)易分配在流動(dòng)相中二、實(shí)驗(yàn)原理移動(dòng)速度慢。移動(dòng)速度快。第9頁(yè)/共23頁(yè)利用阻滯因子Rf值來(lái)表征各組分的差別移動(dòng)：0<Rf<1,適宜范圍0.2~0.8二、實(shí)驗(yàn)原理溶質(zhì)移動(dòng)距離

同一時(shí)間流動(dòng)相移動(dòng)距離Rf=第10頁(yè)/共23頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)原理固定相：一般為水及各種水溶液、甲酰胺、低級(jí)醇等。流動(dòng)相（展層劑）：與水不溶（或微溶）的有機(jī)溶劑。

薄板層析法：支持物:中性、多孔粉末、無(wú)吸附活性、流動(dòng)相自由通過(guò)——硅藻土/纖維素/硅膠/氧化鋁等，親水物質(zhì)能儲(chǔ)留水。本實(shí)驗(yàn)為硅藻土。本實(shí)驗(yàn)為吸附在硅藻土上的EDTA緩沖液。本實(shí)驗(yàn)為丙酮:乙酸乙酯:氯仿=3:1:1第11頁(yè)/共23頁(yè)（四）四環(huán)素廣譜抗生素四環(huán)素發(fā)酵或保管不當(dāng)時(shí)，生成抗菌作用弱，毒性強(qiáng)的差向四環(huán)素。四環(huán)素易溶于流動(dòng)相液體，差向四環(huán)素易溶于固定相液體。氫化駢四苯環(huán)（含共軛雙鍵，可紫外吸收，熒光）

二、實(shí)驗(yàn)原理第12頁(yè)/共23頁(yè)本實(shí)驗(yàn)所需儀器玻璃板研缽天平移液管硅藻土EDTA緩沖液飽和氯化銨缸+架子展層劑展層缸點(diǎn)樣毛細(xì)管小刀和直尺紫外燈氨水三、主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑第13頁(yè)/共23頁(yè)（一）溶液配制（已配置）硅藻土處理：取薄板層析用硅藻土50g，加25ml濃鹽酸和250ml水，攪拌煮沸10min，冷卻，過(guò)濾，用蒸餾水洗，直至洗液對(duì)剛果紅指示劑不顯顏色，然后用流動(dòng)相液體洗滌，過(guò)濾，105℃烘箱干燥。EDTA緩沖液（固定相）：在40ml甘油中，加入10ml聚乙二醇400，搖勻即得20%（V/V）聚乙二醇400的甘油溶液（保濕），再加入950mlpH70.1MEDTA（鰲合）溶液，混勻即得EDTA緩沖液。展層劑（流動(dòng)相）：取pH7EDTA溶液5ml，緩慢加在200ml（丙酮:氯仿:乙酸乙酯=3:1:1）溶液中，然后倒入展層缸中。樣品配制：稱(chēng)取100mg成品四環(huán)素，溶于5ml甲醇中得2%（W/V）溶液。四、實(shí)驗(yàn)方法第14頁(yè)/共23頁(yè)硅藻土

1g研缽EDTA緩沖液2ml蒸餾水0.75ml研勻（顆粒適中、無(wú)氣泡）置飽和NH4Cl缸室溫放置無(wú)明顯水漬厚度涂均勻，特別下邊緣涂滿平整（二）層析操作四、實(shí)驗(yàn)方法第15頁(yè)/共23頁(yè)第16頁(yè)/共23頁(yè)0.5cm15cm1.5cm均勻無(wú)氣泡無(wú)裂紋毛細(xì)管點(diǎn)樣點(diǎn)樣點(diǎn)甲醇揮發(fā)干后，將板放入展層缸內(nèi)，密封晾干，氨氣熏，紫外燈下觀察分別求兩種組分的Rf值量距離展層劑0.5cm樣點(diǎn)高于液面

溶質(zhì)移動(dòng)距離

同一時(shí)間流動(dòng)相移動(dòng)距離Rf=第17頁(yè)/共23頁(yè)第18頁(yè)/共23頁(yè)操作注意點(diǎn)

制板：在研缽中研磨時(shí)應(yīng)緩慢，注意不能產(chǎn)生氣泡。薄板移入飽和氯化銨的缸中時(shí)，不宜太干或太濕，以無(wú)明顯水漬為宜。太干展層太快，引起拖尾；太濕展層太慢。點(diǎn)樣：點(diǎn)樣時(shí)，盡量使點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑小。點(diǎn)樣后，待溶劑揮發(fā)后再移入展層缸內(nèi)，不要用電吹風(fēng)。展層：注意展層劑浸沒(méi)薄層的一端約0.5cm，不能浸沒(méi)樣品斑點(diǎn)。層析缸蓋子應(yīng)蓋密，減少溶劑揮發(fā)。第19頁(yè)/共23頁(yè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論（一）預(yù)習(xí)四環(huán)素的硅藻土薄板層析屬于哪一種層析機(jī)制。固定相和流動(dòng)相分別是什么？為了使層析效果好（不拖尾，分離好），操作中注意事項(xiàng)。（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論在紙上描繪出薄板上斑點(diǎn)的圖形，量出各斑點(diǎn)組分的距離，計(jì)算Rf值。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。總結(jié)本實(shí)驗(yàn)成功或失敗的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。五、思考題第2