輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)定試劑盒說明書

PAGE44頁貨號(hào)規(guī)格管/48樣輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)定試劑盒說明書微量法正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：輔酶ⅠNAD(H)NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）NADH（ETC）傳遞把電子交給氧，在合ATPROS，NADHNAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖TCANAD(H)NADH/NAD+TCA降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。測(cè)定原理：NAD+NADH，NADHPMS570nmNAD+NADH，MTT自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的組成和配制：50mL×1，4℃50mL×1，4℃10mL×1，4℃保存；試劑二：液體3mL×1瓶，4℃保存；試劑三：粉劑×1，-203mL4℃一周；試劑四：粉劑×1，43mL4℃周；3.6mL×1，430mL×1，4℃保存；50mL×1，4℃保存。NAD+和NADH的提取：血清（漿）NAD+NADHNAD+的提?。喊凑昭澹{）體積（mL：酸性提取液體積（mL）1：5~10（建議取0.1mL（漿1mL95℃5mi（蓋緊，以防止水分散失中冷卻后，10000g410min；500μL500μL10min，取上清，置冰上待測(cè)。NADH（漿）體積mL：堿性提取液體積mL）15~10（0.1mL（漿1mL95℃5mi（蓋緊，以防止水分散失中冷卻后，10000g410min；500μL500μL混勻，10000g410min，取上清，置冰上待測(cè)。NAD+NADHNAD+的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g：酸性提取液體積（mL）1：5~10（1mL，冰浴研磨，95℃5min（蓋緊，以防止水分散失冷卻后，10000g410min；500μL500μL勻，10000g410min，取上清，置冰上待測(cè)。NADH（g：堿性提取液體積（m）1：5~10（0.1g1mL，冰浴研磨，95℃5min（蓋緊，以防止水分散失冷卻后，10000g410min；500μL500μL勻，10000g410min，取上清，置冰上待測(cè)。NAD+NADHNAD+的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)：酸性提取液體積（mL）500~1000：1（5001mL，超聲波破碎（20％200W，3s，10s，30，95℃5min（以防止水分散失4500μL500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g410min，取上清，置冰上待測(cè)。NADH104個(gè)：堿性提取液體積（mL）500~1000：1（5001mL，超聲波破碎（20％200W，3s，10s，30，95℃5min（以防止水分散失4500μL500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g410min，取上清，置冰上待測(cè)。測(cè)定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。21.5mLEP：試劑名稱(μL)對(duì)照管測(cè)定管樣本2020試劑一8080試劑二3030試劑三3030試劑四3030試劑五3030試劑六20020min試劑六200充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：試劑七試劑七400400200μL96，570nmA1吸光值A(chǔ)2，計(jì)算△A=A2-A1。注意事項(xiàng)：1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別：對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測(cè)定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。3、反應(yīng)過程中注意避光。410048NAD+NADH.NAD+和NADH含量的計(jì)算：用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下（一）NAD+含量的計(jì)算1、血清（漿）中NAD+含量計(jì)算NAD+含量(nmol/mL）=[(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(V3×V1÷V2)=722×(△A-0.099）2NAD+(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算NAD+(nmol/mgprot）=[(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)=36.1×(△A-0.099）÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算NAD+÷W

(nmol/g鮮重）=[(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)=72.2×(△A-0.099）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算NAD+(nmol/104(△A-0.099）（二）NADH含量的計(jì)算1、血清（漿）中NADH含量計(jì)算NADH(nmol/mL）=-0.065）×24.7×V1)÷(V3×V1÷V2)=494×(△A-0.065）2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADH含量計(jì)算按樣本蛋白濃度計(jì)算NADH(nmol/mg[-0.065）×24.7×V1)]÷(V1×Cpr)=÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算NADH(nmol/g）=(△A-0.065）×24.7×V1)49.4×(△A÷W按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算NADH(nmol/104cell）=[(△A-0.065）×24.7×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A-0.065）V1：加入血清（漿）積：0.1mL；Cprmg/mL；Wg；500500萬。96（一）NAD+含量的計(jì)算1、血清（漿）中NAD+含量計(jì)算NAD+含量(nmol/mL）=[(△A-0.099）×72.2×V1)]÷(V3×V1÷V2)=1444×(△A-0.099）2NAD+(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算NAD+(nmol/mgprot）=[(△A-0.099）×72.2×V1)]÷(V1×Cpr)=72.2×(△A-0.099）÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算NAD+(nmol/g）=-0.099）×72.2×V1)]÷(W×V1÷V2)=÷W按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算NAD+(nmol/104(△A-0.099）（二）NADH含量的計(jì)算1、血清（漿）中NADH含量計(jì)算NADH(nmol/mL）=-0.065）×49.4×V1)÷(V3×V1÷V2)=988×(△A-0.065）2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADH含量計(jì)算按樣本蛋白濃度計(jì)算NADH(nmol/mg[-0.065）×49.4×V1)]÷(V1×Cpr)=÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算NADH(nmol/g）=(△A-0.065）×49.4×V1)98.8×(△A÷W按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)