原核表達(dá)之引物設(shè)計(jì)

原核表達(dá)之

引物設(shè)計(jì)自從1985年KarnyMullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以來(lái),PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用最多、最廣泛的手段之一,而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)引物設(shè)計(jì)原則1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)2.引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃

Tm=4（G+C）+2（A+T）

4.引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T6.堿基要隨機(jī)分布引物設(shè)計(jì)原則7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列8.引物5′端和中間△G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3′端△G值較低9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾10.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)11.引物應(yīng)具有特異性常用引物設(shè)計(jì)軟件PremierPrimer5.0Oligo6.0VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPremierPrimer5.0主要功能:1.自動(dòng)搜索2.引物設(shè)計(jì)3.限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析4.DNA基元(motif)查找5.同源性分析Oligo6.01.功能較PremierPrimer5.0更為單一，主要是引物設(shè)計(jì)及引物評(píng)價(jià)2.常與PremierPrimer5.0聯(lián)合使用進(jìn)行原核表達(dá)所用引物的設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析鴨疫里氏桿菌（Riemerella

anatipestifer）ompA

登錄NCBI：/共１１６４ｂｐ，按照把各位數(shù)字相加，除以３得整數(shù)，即可認(rèn)為這一序列能編碼完整的氨基酸序列鴨疫里氏桿菌ompA序列ATGGACAAGGAGTTTATGTTGATGACTGGTCTTGGTCTTCAGCTTAAATTTGCTGGTCTTCTTTTTGGAAACGAAGATGCGTGGTTTGACCCTTATGTAAGAGTTGGAGCCAACTATTTGAGACACGACTATACAGGTCTTACGTTCCCTGTGACTGATAGCTACAATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGAAAATAAACCATACACTCAAGGAAGAGCGGATCATTTTGCTTTATCAACAGGTTTAGGTACAAACATTTGGTTAACTAAGAACTTTGGTCTTGGTATCCAAGGGGATTATGTTTCTACTCCAGTAGATAAGTCTGGATTGGCTAACTTTTGGCAAGCGTCAGCTTCATTGAACTTTAGATTTGGTAACAGAGATAAGGATAAGGATGGAGTGTTAGATAAAGACGATTTATGTCCAGAAATACCAGGTTTACCTGAATTCCAAGGTTGTCCAGATACAGATGGCGATGGAGTTCCAGATAAAGATGATAACTGTCCAGAAGTTGCAGGACCAGTTGAAAACAACGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGACAAAGATGGTGTATTGGATAAAGACGATGCTTGTGTTGATGTAGCTGGACCTGCTGAAAACAATGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGATAATGATGGAGTATTAGATAAAGATGATAAGTGTCCTAATGTTCCAGGTCTTCCAGAATACAAAGGTTGTCCTAAGCCTCAGGAAGCGTATGCAGTTGAAGCAACAGGAGCATTAAAGGGTATATTCTTCAACTTTAATAAAGCATCTATCAGACCTGAATCTAATACTAAGTTAGATCAAGCTGCTGAAGTGATTAAGTCTTCTAACGGAGGTACTTTCTTAGTGGTAGGTCATACGGATGTTAAGGGTAATGCTAACTACAACTTGAAACTTTCTAGAGAAAGAGCTGCATCTGTAGTAGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGAGTTAATCCATCTCAGTTAAAATCTAAAGGGGTTGGTTCTGCTGAAGCTACAGTACCAGCGTCTGCTTCTAACGAAGAGAGAATGAAAGACAGAAAAGTGGTTGTAGAAGCAATCAGCGGATCTGCTTGGGAAGCTCTTCAAAAGTCTGATCTTCCAGTAGTGAAGAAAAAAGTAGTAAAAAAGAAAAGAAAATAA將基因序列復(fù)制粘貼到EditSeq軟件內(nèi)并保存將DNASequence翻譯成氨基酸序列Control+A

選中DNASequence,點(diǎn)擊“Goodies”>>>“TranslateDNA”查看有無(wú)信號(hào)肽（SignalPeptide）SignalP3.0Server:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/打開(kāi)Oligo6.0點(diǎn)擊“ｃｈａｎｇｅ”＞＞＞＞“CurrentoligolengthＦ９”

點(diǎn)擊“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞

“ＰＣＲＡｌｔ＋Ｐ”點(diǎn)擊“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞

“ＦａｌｓｅＰｒｉｍｉｎｇｓｉｔｅｓ”＞

“Ｕｐｐｅｒｐｒｉｍｅｒ”下拉滾動(dòng)條，下一方塊中的數(shù)值要求同上同樣的操作查看”FalsePrimingSites”選項(xiàng)中“LowerPrimer”的各項(xiàng)數(shù)值是否合適點(diǎn)擊“Edit”>