乙型肝炎病毒RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）（CSZ1900206）

CSZ1900206乙型肝炎病毒RNA（PCR-熒光探針法）申請—1—HYPERLINK\l"br3"基本信息HYPERLINK\l"br3".....................................................................................3HYPERLINK\l"br3"一、申請人名稱HYPERLINK\l"br3"HYPERLINK\l"br3".........................................................................3HYPERLINK\l"br3"二、申請人住所HYPERLINK\l"br3"HYPERLINK\l"br3".........................................................................3HYPERLINK\l"br3"三、生產(chǎn)地址HYPERLINK\l"br3".............................................................................3HYPERLINK\l"br4"技術(shù)審評概述HYPERLINK\l"br4".............................................................................4HYPERLINK\l"br4"一、產(chǎn)品概述HYPERLINK\l"br4".............................................................................4HYPERLINK\l"br5"二、臨床前研究概述HYPERLINK\l"br5"HYPERLINK\l"br5".................................................................5HYPERLINK\l"br12"三、臨床評價概述HYPERLINK\l"br12"HYPERLINK\l"br12"...................................................................12HYPERLINK\l"br15"四、產(chǎn)品受益風險判定HYPERLINK\l"br15"HYPERLINK\l"br15"...........................................................15HYPERLINK\l"br17"綜合評價意見HYPERLINK\l"br17"...........................................................................18—2—一、申請人名稱北京熱景生物技術(shù)股份有限公司二、申請人住所北京市大興區(qū)中關(guān)村科技園區(qū)大興生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地天富街9號9幢三、生產(chǎn)地址北京市大興區(qū)中關(guān)村科技園區(qū)大興生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)基地天富街9號9幢—3—技術(shù)審評概述產(chǎn)品概述一)產(chǎn)品主要組成成分本試劑盒由A盒（磁珠法核酸提取試劑）和B盒（擴增反應(yīng)試劑）組成，主要組成成分見表。表1試劑盒主要組成成分A盒：規(guī)格1411121311B盒：規(guī)格1酶I酶11AB1含1含1A1B含112含）含）113含）1含1—4—4）具體內(nèi)容詳見產(chǎn)品說明書。產(chǎn)品預(yù)期用途本試劑盒用于體外定量測定人血清樣本中的乙型肝炎病毒RNA（HBV-RNA）。已有研究數(shù)據(jù)顯示，外周血血清中HBV-RNA可反映肝內(nèi)HBV病毒的轉(zhuǎn)錄活性，在部分血清中HBVDNA低于檢測下限的樣本中，HBV-RNA仍可以被檢測到。同時，在NAs治療HBV-RNA可輔助作為HBeAg轉(zhuǎn)陰的預(yù)測的指標之一，血清HBV-RNA結(jié)果為陰性，需要結(jié)合其他指標共同用于指導(dǎo)NAs的治療。該檢測結(jié)果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。本試劑盒不得用于HBV的血液篩查。產(chǎn)品包裝規(guī)格48人份/盒。（四）產(chǎn)品檢驗原理本試劑盒（PCR-熒光探針法）采用磁珠法提取血清中的HBV-RNA。特異性地檢測HBV-RNA的保守區(qū)域。檢測試劑內(nèi)含有一條反轉(zhuǎn)錄引物、一對特異性擴增引物以及一條熒光探RT-PCR反應(yīng)緩沖液，Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶等共同配制成RT-PCRPCR儀上進行一步法RT-PCR擴增，實現(xiàn)對血清樣本中HBV-RNA的檢測。二、臨床前研究概述—5—()1.主要原材料的選擇本產(chǎn)品的主要原材料包括：引物、探針、假病毒、PCR反應(yīng)體系（包括10×RT-PCRBuffer（含dNTPs）、逆轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA聚合酶混合液）、磁珠法核酸提取試劑等，這些原材料均是通過外購方式獲得。其中，引物和探針均為申請人自行設(shè)計，由專業(yè)的合成公司合成和純化后獲得。申請人從有資質(zhì)的供應(yīng)商中，通過功能性試驗，篩選出最佳原材料和供應(yīng)商。制定了各主要原材料質(zhì)量標準并經(jīng)檢驗合格。2.企業(yè)參考品設(shè)置情況該產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品、檢出限參考品、準確度參考品、樣本線性參考品、核酸提取功能參考品，參考品采用臨床樣本制備而成。組成如下：陽性參考品共10份，分別命名為陽性參考品P1~P10，來源于HBV-RNA陽性樣本，涵蓋B型、C型和D型。陰性參考品共10份，分別命名為陰性參考品N1~N10，涵蓋正常人樣本、巨細胞病毒、EB病毒、人類免疫缺陷病毒1型、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和梅毒樣本。精密度參考品共2J1~J2，—6—采用HBV-RNA陽性樣本梯度稀釋而成。檢出限參考品1S1RNA陽性樣本稀釋而成，濃度為300copies/mL。準確度參考品共5Y1~Y5，采用HBV-RNA陽性樣本梯度稀釋而成，濃度分別為2.0×107copies/mL、2.0×106copies/mL、2.0×105copies/mL、2.0×104copies/mL、2.0×103copies/mL。樣本線性參考品1份，命名為樣本線性參考品L，采用HBV-RNA陽性樣本稀釋而成。核酸提取功能參考品共12參考品T1~T12中T1~T8采用含內(nèi)源性干擾物質(zhì)的RNA陽性樣本稀釋而成，T1T5T9含血紅蛋白，T2T6、T10含甘油三脂，T3、T7、含總IgG，T4、T8、T12含總膽紅素，T9~T12為陰性血清樣本。以上臨床樣本采用數(shù)字PCR法和實時熒光PCR法進行確認。各企業(yè)參考品用于產(chǎn)品準確性、特異性、檢出限、精密度、線性、核酸提取功能等的檢測。本試劑盒設(shè)置了陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，用于檢測過程中試劑盒和儀器的質(zhì)量控制。此外，每個樣本均檢測1個內(nèi)標，用于評估核酸提取和PCR擴增的質(zhì)量和結(jié)果的判讀。二)生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究—7—申請人對試劑盒反應(yīng)體系的研究包括對HBV-RNA特異性引物/探針濃度的確定、內(nèi)標引物/探針濃度的確定、反應(yīng)液的選擇、反應(yīng)體積的確定、核酸提取試劑的確定、DNA酶I的用量確定等；對反應(yīng)條件的研究包括PCR退火溫度、擴增循環(huán)數(shù)、擴增反應(yīng)時間，DNA酶I的作用溫度和時間的篩選和優(yōu)化；對樣本用量、內(nèi)標用量、核酸提取液體積等進行了研究。申請人通過功能性實驗，確定了最佳的反應(yīng)體系。并根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。（三）分析性能評估該產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容包括核酸提取功能、檢出限、線性范圍、準確度、精密度、分析特異性（交叉反應(yīng)、干擾物質(zhì)）、HBVDNA干擾濃度等。申請人提交了有效運行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的三批產(chǎn)品在3種適用機型（ABIPrism7500LightCycler4809600plus評估資料。在核酸提取功能評估中，申請人使用含有28mg/dL總膽紅素、22g/dL血紅蛋白、3000mg/dL甘油三酯、40g/L總IgG的HBV-RNA陰性血清樣本稀釋已知濃度的HBV-RNA強陽性樣本，制備成高、低濃度樣本進行研究，結(jié)果表明以上干擾物質(zhì)對核酸提取性能無影響。—8—在檢出限的性能評估中，申請人對HBV-RNA臨床血清樣本（B型、C型、D型）和HBV-RNA假病毒樣本（A型、E型、F型、G型）進行梯度稀釋，采用三批次試劑對系列濃度樣本分別進行20次重復(fù)檢測，以≥95%陽性檢出率的最低稀釋濃度作為檢出限，最終確定該產(chǎn)品檢出限為300copies/mL。采用三批試劑對HBV-RNA臨床血清樣本（B型、C型、D型）和HBV-RNA假病毒樣本（A型、E型、F型、G型）進行檢出限的重復(fù)性檢測驗證，符合檢出限的性能要求。在線性范圍的性能評估中，申請人采用不同基因型的樣9個濃度的樣本進行線性范圍研究，產(chǎn)品在1.0×103copies/mL~1.0×108copies/mL范圍濃度呈線性相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.9800，符合線性范圍的性能要求。在準確度的性能評估中，申請人采用HBV-RNA陰性樣本對陽性樣本進行系列稀釋，分別制備成2.0×107copies/mL、2.0×106copies/mL、2.0×105copies/mL、2.0×104copies/mL、2.0×103copies/mL共5個梯度樣本進行準確度研究，結(jié)果表明檢測濃度的對數(shù)值與理論濃度的對數(shù)值的絕對偏差不超過±0.5個對數(shù)數(shù)量級，符合準確度的性能要求。2個濃度的HBV-RNA精密度樣本進行檢測，分別對批內(nèi)、批間檢測結(jié)果進行—9—分析，結(jié)果表明精密度樣本的變異系數(shù)均不高于5%，符合精密度的性能要求。分析特異性研究包含交叉反應(yīng)和干擾研究。交叉反應(yīng)的性能評估中，申請人對人巨細胞病毒、EB病毒、人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人類皰疹病毒6型、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、甲型流感病毒、丙酸痤瘡桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌樣本進行交叉反應(yīng)評價。結(jié)果顯示，上述樣本與本產(chǎn)品均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。干擾研究實驗中，申請人采用在中低濃度的HBV-RNA樣1.3μg/mL阿德福韋酯（21.24ng/mL）、恩替卡韋（3.46μg/mL）、替比夫定（3.69μg/mL）、普通IFNα（2020pg/mL）、聚乙二醇干擾素α（10.88μg/L）、總膽紅素（≤28mg/dL油三酯（≤3000mg/dL）、血紅蛋白（≤22g/dL）、總IgG（≤40g/L）及不高于2×107IU/mL的HBVDNA對本產(chǎn)品檢測結(jié)果均不產(chǎn)生干擾。（四）陽性判斷值或參考區(qū)間研究本產(chǎn)品的陽性判斷值研究，采用乙肝感染者的血清樣本（B型、C型、D型）及不同人的陰性血清樣本共249例，使用本試劑盒進行陽性判斷值研究，對檢測靶標Ct值進行ROC分析，確定其陽性判斷值為靶標Ct≤26。通過對HBV—10—DNA陽性/陰性、HBsAg陽性/陰性及HBeAg陽性/陰性樣本的靶標進行Ct值分析，HBVDNA陽性/陰性、HBsAg陽性/陰性及HBeAg陽性/陰性對靶標陽性判斷值的判定無影響。本產(chǎn)品預(yù)測HBeAg轉(zhuǎn)陰的陽性判斷值研究，采用79例慢性HBV感染者（B型、C型、D型）隊列血清樣本（0周、48周、5年），使用本試劑盒進行檢測，對檢測結(jié)果分別計算B、C、D型的ROC曲線和最佳預(yù)測cutoff值，結(jié)果顯示均不具有顯著差異；將B型、C型、D型樣本合并共同用于確定預(yù)測治療5年后e抗原轉(zhuǎn)陰的最佳cutoff值為708copies/mL。此時的PPV為81.8%，NPV為87.0%。（五）穩(wěn)定性研究申請人對本產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性、開瓶及凍融次數(shù)限度穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性進行了研究，同時，對樣本的穩(wěn)定性也進行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品及樣本的有效保存時間。實時穩(wěn)定性：將三批次試劑的A盒置于10~30℃，B盒置于-20±5℃的條件下保存，連續(xù)7個月對試劑盒的外觀、陰陽性符合率、檢出限、線性、準確度、精密度進行考察，各項性能指標均符合要求，確定產(chǎn)品在規(guī)定的儲存條件下，可穩(wěn)定保存6個月。此外，申請人對產(chǎn)品的開瓶及凍融次數(shù)限度穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性分別進行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品的—11—性能均滿足產(chǎn)品說明書聲稱的要求。申請人在首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院、蘭州大學第二醫(yī)院、沈陽市第六人民醫(yī)院共3家機構(gòu)完成了臨床試驗，對考核試劑檢測人血清中HBV-RNA的臨床準確性和臨床有效性進行驗證。()臨床準確性驗證采用考核試劑與參比方法對臨床樣本進行比較研究試驗的方法驗證本產(chǎn)品的臨床準確性。入組樣本為慢性HBV感染者、其他肝臟疾病干擾樣本以及非肝臟疾病的正常人血清樣本，共計1033例。參比方法選擇ABIQuantStudio3D芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)。臨床準確性研究在3家臨床單位共檢測了1033例血清樣本，實際納入檢測1033例，包括慢性HBV感染者樣本709例（68.64%），其他肝臟疾病干擾樣本78例（7.55%），非肝臟疾病的正常人樣本246例（23.81%）；675例有分型結(jié)果的樣本中，B基因型160例、C基因型464例、D基因型51例。對1033例入組血清樣本進行考核試劑和參比方法符合率分析，陽性符合率99.26%（95%CI：98.11%~99.80%）、陰性符合率98.99%（95%CI：97.65%~99.67%）、總體符合率99.13%（95%CI：98.35%~99.60%）；Kappa（K）—12—=0.983，考核試劑和參比方法具有較好的一致性。相關(guān)性分析顯示考核試劑和參比方法的線性相關(guān)系數(shù)r=0.9864，回歸分析得出的線性回歸方程為y=0.9854x+0.1123a的95%的置信區(qū)間為[0.0255，0.1992]，斜率b的95%的置信區(qū)間為[0.9693，1.0015]。對675例有基因分型數(shù)據(jù)的樣本檢測結(jié)果進行分析。B基因型血清樣本，考核試劑與參比方法定量檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.9873，線性回歸方程為y=0.9973x+0.0083，截距a的95%置信區(qū)間為[-0.1876，0.2042]，斜率b的95%置信區(qū)間為[0.9625，1.0321]；C基因型血清樣本，考核試劑與參比方法定量檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.9853，線性回歸方程為y=0.9876x+0.1229，截距a的95%置信區(qū)間為[0.0161，0.2296]，斜率b的95%置信區(qū)間為[0.9672，1.0080]；D基因型血清樣本，考核試劑與參比方法定量檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.9918，線性回歸方程為y=1.0241x-0.1546，截距a的95%置信區(qū)間為[-0.4375，0.1290]，斜率b的95%置信區(qū)間為[0.9748，1.0732]。考核試劑與參比方法的定量檢測結(jié)果（lgcopies/mL）之差在±0.5范圍內(nèi)。綜上所述，申請人考核試劑與參比方法檢測結(jié)果一致。()臨床有效性研究本研究中分別對考核試劑定量檢測血清HBV-RNA用于預(yù)—13—測NAs治療患者HBeAg轉(zhuǎn)陰、HBVDNA低濃度的CHB患者中HBV-RNA的檢出率進行臨床有效性研究。1.考核試劑定量檢測血清HBV-RNA用于預(yù)測NAs抗病毒治療患者HBeAg轉(zhuǎn)陰研究采用考核試劑對來源于回顧性隊列樣本的78受NAs抗病毒治療的HBeAg陽性慢性HBV感染者）的共624例血清樣本進行HBV-RNA8個標本，分別對應(yīng)治療前和治療中的8個不同檢測點：即NAs抗病毒治療第0周、24周、48周、1.5年、2年、3年、4年、5年。優(yōu)選治療第48周血清樣本中的HBVDNA、HBV-RNA定量值用于預(yù)測治療五年后（一個治療周期）HBeAg轉(zhuǎn)陰的受試者工ROC）分析和這些定量值對HBeAg轉(zhuǎn)陰的預(yù)測值分析。分析結(jié)果顯示，NAs藥物治療的78例HBeAg陽性患者中，治療48周HBVDNA定量和HBV-RNA定量預(yù)測NAs藥物治療五年后HBeAg轉(zhuǎn)陰的曲線下面積（AUC）依次為0.736和0.874。HBVDNA以156.0IU/mL為閾值獨立預(yù)測治療5年HBeAg轉(zhuǎn)陰的陽性預(yù)測值為60.9%，陰性預(yù)測值為84.4%；HBV-RNA以708copies/mL為閾值獨立預(yù)測治療5年HBeAg轉(zhuǎn)陰的陽性預(yù)測值為80.6%83.3%HBV-RNA在治療48周后預(yù)測五年HBeAg轉(zhuǎn)陰的預(yù)測價值優(yōu)于血清HBVDNA的預(yù)—14—測價值。2.HBVDNA低濃度HBV感染者中HBV-RNA檢出率研究本次臨床試驗共包含374例HBVDNA低濃度（＜500IU/ml）或未檢出樣本，其中HBVDNA陰性227例。在HBVDNA陰性樣本中，HBV-RNA檢出陽性145例，陽性檢出率為63.88%（145/227）；在374例HBVDNA＜500IU/mL的慢性HBV感染者樣本中，HBVDNA檢出陽性147例，陽性檢出率39.30%（147/374HBV-RNA檢出陽性249例，陽性檢出率66.58%（249/374），χ2=54.26，P＜0.05，具有顯著差異?？梢娫贖BVDNA低濃度或未檢出的慢性HBV感染者中，HBV-RNA具有較高的檢出率。綜上所述，臨床試驗結(jié)果顯示本產(chǎn)品的臨床性能滿足技術(shù)審評要求。產(chǎn)品受益風險判定()受益評估本產(chǎn)品可用于對乙型肝炎病毒感染的輔助診斷，也可以對NAs的治療效果作出預(yù)測。我國乙型肝炎患者比較多，NAs治療可以提高乙型肝炎患者的治愈率，單獨檢測HBVDNA可能存在漏檢風險，研究表明，通過對HBVDNA已經(jīng)檢測不到的患者進行HBV-RNA的檢測，可以輔助對患者病情進行監(jiān)測。()風險評估—15—該試劑盒已知和可預(yù)見的安全風險主要有以下幾個方面：1.與預(yù)期用途有關(guān)的安全風險，例如本產(chǎn)品的檢測結(jié)果非患者病情評價的唯一指標，未結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。2.與生產(chǎn)有關(guān)的安全風險，例如使用未經(jīng)過驗證或檢驗不合格的原材料。3.與運輸與儲存有關(guān)的安全風險，例如試劑的運輸和儲存超出規(guī)定條件。4.與使用有關(guān)的安全風險，例如使用儀器和試劑時沒有按照說明書要求進行操作。5.生物危險，例如直接丟棄使用后或失效的產(chǎn)品或產(chǎn)品使用過程中產(chǎn)生的廢棄物未按照醫(yī)療廢棄物統(tǒng)一銷毀處理。通過對乙型肝炎病毒RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）從生產(chǎn)原材料、配制、檢測、包裝、運輸、儲存、使用方法及安全注意事項、保存和用后處理等全過程危害判定、風險估計、預(yù)防化解，從產(chǎn)品技術(shù)要求和使用說明書及企業(yè)規(guī)章制度對產(chǎn)品質(zhì)量的全過程控制和風險防范措施，已將產(chǎn)品的安全風險系數(shù)降到了驗收準則規(guī)定的可接受范圍內(nèi)，同時采取降低風險的措施后沒有引入新的風險。在目前認知水平上，認為該產(chǎn)品上市帶來的受益大于風險。盡管目前認為該試劑盒的受益大于風險，但是為保證用械安全，基于對主要剩余風險的防控，已在該試劑盒說明書中提示以下—16—信息：1.預(yù)期用途：本試劑盒用于體外定量測定人血清樣本中的乙型肝炎病毒RNA（HBV-RNA）。已有研究數(shù)據(jù)顯示，外周血血清中HBV-RNA可反映肝內(nèi)HBV病毒的轉(zhuǎn)錄活性，在部分血清中HBVDNA低于檢測下限的樣本中，HBV-RNANAs治療中，血清HBV-RNA可輔助作為HBeAg轉(zhuǎn)陰的預(yù)測的指標之一，血清HBV-RNA結(jié)果為陰性，需要結(jié)合其他指標共同用于指導(dǎo)NAs的治療。該檢測結(jié)果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。本試劑盒不得用于HBV的血液篩查。2.警示及注意事項：該試劑盒說明書中明確了該試劑盒檢驗方法的局限性及注意事項?！?7—本申報項目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊。申請人的（國務(wù)院令第680國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評價后，建議準予注冊。2022年11月10日附件：產(chǎn)品說明書—18—乙型肝炎病毒（）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書【產(chǎn)品名稱】通用名稱：乙型肝炎病毒RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）【包裝規(guī)格】人份/盒【預(yù)期用途】本試劑盒用于體外定量測定人血清樣本中的乙型肝炎病毒RNAHBV-RNA）。HBV-RNA可反映肝內(nèi)DNAHBV-RNA仍可以被檢測到。同時，在NAs治療中，血清HBV-RNA可輔助作為HBeAg轉(zhuǎn)陰的預(yù)測的指標之一，血清HBV-RNA結(jié)合其他指標共同用于指導(dǎo)NAs的治療。該檢測結(jié)果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。本試劑盒不得用于HBV的血液篩查?！緳z驗原理】本試劑盒（PCR-熒光探針法）采用磁珠法提取血清中的HBV-RNA。特異性的檢測HBV-RNA的保守區(qū)域。檢測試劑內(nèi)含有一條反轉(zhuǎn)RT-PCR量PCR儀上進行一步法RT-PCR擴增，實現(xiàn)對血清樣本中HBV-RNA的檢測?！局饕M成成分】組成部分規(guī)格/主要組成成分磁珠法核酸提取試劑裂解液磁珠溶液洗液1洗液2洗液3洗脫液10.0mL（11.0mL（115.0mL（15.0mL（130.0mL（12.5mL（11%SDS25mM；10mM3O4磁性顆粒400mM氯化鈉；30mM400mM氯化鈉；0.5M乙酸鉀；30mM200mM氯化鈉；30mM10mM氯化鈉；10mMHBV-RNA內(nèi)標50μL（1含內(nèi)標片段的假病毒溶液DNA酶I100μL（1DNA酶I，甘油HBV-RNA反應(yīng)液A0.5mL（1HBV-RNA特異性引物及探針、內(nèi)標引物及探針、、10×RT-PCRHBV-RNA反應(yīng)液B1.25mL（12×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶擴增反應(yīng)HBV-RNA弱陽性質(zhì)控品1.0mL（1含HBV-RNA目標片段的假病毒溶液試劑HBV-RNA強陽性質(zhì)控品1.0mL（1含HBV-RNA目標片段的假病毒溶液陰性質(zhì)控品A1.0mL（1陰性血漿/血清（已滅活）陰性質(zhì)控品B1.0mL（1含HBV-DNA目標片段的假病毒溶液HBV-RNA陽性定量參考品11.0mL（1含HBV-RNA目標片段的假病毒溶液（1.0×104copies/mL）HBV-RNA陽性定量參考品21.0mL（1含HBV-RNA目標片段的假病毒溶液（1.0×105copies/mL）—19—HBV-RNA陽性定量參考品31.0mL（1含HBV-RNA目標片段的假病毒溶液（1.0×106copies/mL）HBV-RNA陽性定量參考品41.0mL（1含HBV-RNA目標片段的假病毒溶液（1.0×107copies/mL）備注：1）不同批號產(chǎn)品間的成分不得混用或互換。21.5mL的RNase-Free規(guī)格：10μL、200μL、1000μL）；離心機；震蕩混合器；磁珠分離器；各種規(guī)格的移液器?！緝Υ鏃l件及有效期】本試劑盒有效期6AB℃保存。B盒（擴增反應(yīng)試劑）應(yīng)避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不超過5次；試劑開瓶后，在室溫條件下放置時間不應(yīng)超過8小時。本試劑盒生產(chǎn)日期和失效日期見產(chǎn)品包裝標簽?！具m用儀器】實時熒光定量PCR儀：ABIPrism7500，LightCycler4809600plus?！緲颖疽蟆?.適用標本類型：血清。2.標本采集：靜脈采血后小時內(nèi)分離，然后吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5mL滅菌離心管備用。3.樣本保存：經(jīng)上述處理后的待測血清樣本可立即用于檢測，或℃保存（3個月）?？捎凇嬉韵麻L期保存65個月。應(yīng)避免反復(fù)凍融?！緳z驗方法】1.試劑準備（在試劑準備區(qū)進行）1.1取出兩個包裝盒中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫后，混勻備用；1.2在裂解液中加入5mL異丙醇，充分混勻后備用。1.3在洗液1中加入mL無水乙醇，充分混勻后備用。1.4在洗液2中加入mL無水乙醇，充分混勻后備用。1.5A和B1~4300μL/人份+HBV-RNA1.0μL/人份的比例，取相應(yīng)量的裂解液及HBV-RNA內(nèi)標，充分混勻成裂解液mix備用。1.6A和1~448μL/人份洗脫液+2.0μL/人份的DNA酶I比例，取相應(yīng)量的洗脫液及DNA酶，充分混勻成洗脫液mix備用。1.7A和B1~4HBV-RNA反應(yīng)液A10μL/人份+HBV-RNA反應(yīng)液B25μL/HBV-RNA反應(yīng)液A及HBV-RNA反應(yīng)液BPCR-mix35μL/人份分裝至PCR反應(yīng)管中，蓋上PCR反應(yīng)管蓋，瞬時離心后備用。1.8將上述準備好的試劑轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)，待用。2.樣本處理（在樣本處理區(qū)進行）（陰性質(zhì)控品A和、弱陽性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品、陽性定量參考品（）與待測樣本同步處理)2.1在1.5mL的RNase-Free離心管中依次加入20μL磁珠溶液（使用前顛倒混勻或使用移液器吹吸混勻磁珠）、300μL裂解液mix、200μL樣本，震蕩混勻各離心管，室溫下顛倒混勻10分鐘或反復(fù)吹吸混勻分鐘。2.2將離心管置于磁力架上1分鐘，使管內(nèi)磁珠被吸附，用移液器移走管內(nèi)液體，取下離心管。2.3500μL112.4500μL，使磁珠重新懸浮，將離心管置于磁力架上1分鐘，使管內(nèi)磁珠被吸附，用移液器移走管內(nèi)液體，同時保持離心管置于磁力架上，使磁珠繼續(xù)被吸附。2.5550μL3，盡量不要沖起磁珠，1分鐘后用移液器移走管內(nèi)液體，取下離心管?！?0—2.650μLRNA洗脫液37℃分鐘（樣本處理前將水浴鍋或金屬浴溫度設(shè)置成℃動兩次使核酸充分洗脫。2.7將離心管置于磁力架1分鐘，使磁珠被吸附，將液體轉(zhuǎn)移至新的1.5mL無核酸酶的離心管中。2.8取洗脫后的樣本提取液35μLPCR-mix的PCR加入順序。2.9如操作時，發(fā)現(xiàn)管壁和管蓋有液體，請瞬時離心使液體甩入管底，再置于磁力架上。3.PCR擴增（在擴增與產(chǎn)物分析區(qū)進行）（請參照各儀器使用說明書進行設(shè)置）3.1將PCR反應(yīng)管放入實時熒光定量PCRA和陽性定量參考品（1~4）的數(shù)量，并設(shè)置樣本名稱及陽性定量參考品（1~4）的濃度。3.2熒光檢測通道選擇：選擇通道檢測或VIC通道檢測HBV-RNASampLe為50Dyenone。3.3反應(yīng)程序設(shè)定：反應(yīng)程序反應(yīng)溫度反應(yīng)時間循環(huán)數(shù)150℃15min1295℃5min1395℃30s62℃45s1095℃30s45s43562℃（在此步驟結(jié)束后收集熒光信號）設(shè)置完畢，保存文件，運行反應(yīng)程序。4.結(jié)果分析（請參照各儀器使用說明書進行設(shè)置）HBV-RNAVIC或后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、值以及Threshold值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start3-15之間、End值可設(shè)在5-20之間，調(diào)整閾值線位于擴增曲線指數(shù)期且陰性質(zhì)控品A符合質(zhì)量控制要求），點擊進行分析，在Report界面查看結(jié)果，記錄樣本檢測結(jié)果數(shù)值（）。5.質(zhì)量控制程序每次實驗均需檢測陰性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品、HBV-RNA弱陽性質(zhì)控品、HBV-RNA陽性定量參考品（1~4）。質(zhì)控品結(jié)果滿足如下要求時，方可進行檢測結(jié)果判定。5.1HBV-RNAA和B：檢測結(jié)果均為陰性。5.2HBV-RNA陽性質(zhì)控品：檢測結(jié)果均為陽性，HBV-RNA強陽性質(zhì)控品定值范圍在1.0×10～5.0×108copies/mL，HBV-RNA弱陽性質(zhì)控品定值范圍在1.0×104～5.0×105。5.3陽性定量參考品（1）：檢測結(jié)果均為陽性，且標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2≥0.98。以上要求需在實驗中同時滿足，否則本次實驗無效，需重新測定。【陽性判斷值】檢測249例臨床樣本，利用曲線分析確定靶標陽性判斷值為Ct≤26?！緳z驗結(jié)果的解釋】1.陰性結(jié)果判定：通道無“S”型擴增曲線或值＞26，VIC/通道有明顯型擴增曲線，且值。則樣本未檢測到HBV-RNA，樣本濃度低于試劑盒的檢出限。2.陽性結(jié)果判定：通道為“S”型擴增曲線，并且Ct值≤26，VIC/HEX通道擴增為型曲線，且Ct值≤32。2.1C<300copies/mL：檢出濃度低于檢出限，檢測結(jié)果的陽性檢出率＜95%?！?1—2.2300<1.0×103copies/mL：檢出濃度位于檢出限與線性范圍下限之間，檢測結(jié)果的陽性檢出率≥95%。2.31.0×103≤C≤1.0×108copies/mL：檢出濃度位于線性范圍內(nèi)，線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r≥0.9800。2.4C>1.0×108copies/mL，檢出濃度高于線性范圍上限，如有必要，可將樣本用陰性質(zhì)控品A或B稀釋至線性范圍內(nèi)再檢測。3.若內(nèi)標值或者無顯示，則該樣本的檢測結(jié)果無效?！緳z驗方法的局限性】樣本檢測結(jié)果與樣本的收集、處理、運送及保存質(zhì)量有關(guān)，其中任何失誤都可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準確。如果樣本處理時未控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果?！井a(chǎn)品性能指標】1.準確性：準確度參考品的檢測結(jié)果為陽性，且濃度的對數(shù)值與理論濃度的對數(shù)值的絕對偏差不超過個對數(shù)數(shù)量級。2.參考品符合率：陰性參考品符合率，陽性參考品符合率均為100%。3.檢出限：檢出限為300copies/mL。4.線性范圍：線性范圍為1×10～1×108copies/mL，線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9800。5.精密度：批內(nèi)精密度CV≤5%。6.經(jīng)過對基因型（、、FG為假病毒模擬樣本，CD為臨床樣本）驗證，臨床研究中對基因型CD驗證，本試劑盒可以檢測A~G。7.試劑盒與人巨細胞病毒、病毒、人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人類皰疹病毒6型、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、甲型流感病毒、丙酸