第十一章 蛋白質(zhì)的生物合成

第十一章蛋白質(zhì)的生物合成學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握：翻譯的概念；參與翻譯的物質(zhì)及其作用；遺傳密碼的含義及特點；mRNA、tRNA、rRNA在翻譯過程中的作用和相互配合關(guān)系；氨基酰-tRNA合成酶的作用；核糖體循環(huán)；基因工程、限制性核酸內(nèi)切酶和質(zhì)粒的概念。熟悉：遺傳密碼表的用法；藥物對遺傳信息傳遞過程的影響；基因工程的主要步驟。了解：原核生物翻譯過程；翻譯后的加工；基因工程與醫(yī)學(xué)的關(guān)系。RNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)RNADNA復(fù)制復(fù)制反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯遺傳信息傳遞的中心法則

概述蛋白質(zhì)生物合成:是指mRNA分子上核苷酸的遺傳信息，變成蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸排列順序的過程。翻譯:遺傳信息（堿基排列順序，英文）由mRNA攜帶到蛋白質(zhì)多肽鏈上體現(xiàn)為氨基酸殘基排列順序（中文）的過程，類似一種語言翻譯成另一種語言時的情形相似，所以稱為翻譯。

以mRNA為直接模板合成蛋白質(zhì)的過程稱為翻譯。特點：翻譯過程十分復(fù)雜

參與因素多、合成步驟繁蛋白質(zhì)的生物合成體系一、20種氨基酸二、mRNA和遺傳密碼三、tRNA四、核糖體五、酶和輔助因子及無機離子、以ATP、GTP合成方向：N→C端第一節(jié)參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)一、合成原料

20種氨基酸（AA）二、酶及蛋白因子

1.氨基酰-tRNA合成酶

催化氨基酸的活化以及與對應(yīng)tRNA的結(jié)合反應(yīng)。至少20種以上，具有絕對特異性，對氨基酸及tRNA都能高度特異地識別，此外還具有校正活性，可將反應(yīng)任一步驟中出現(xiàn)的錯誤加以改正，是保證翻譯準(zhǔn)確性的關(guān)鍵物質(zhì)。

2.轉(zhuǎn)肽酶：存在于核蛋白體大亞基上，能催化給位（P位）上肽酰-tRNA的肽?；D(zhuǎn)移至受位（A位）上氨基酰-tRNA的氨基上，使?；c氨基縮合形成肽鍵。酶及蛋白因子3.蛋白因子

包括起始因子（IF）是一些與多肽鏈合成起始有關(guān)的蛋白因子。其作用主要是促進核蛋白體小亞基與起始tRNA及模板mRNA的結(jié)合。延長因子（EF）是一類直接參與多肽鏈延長階段的蛋白因子。其作用主要是促進氨基酰-tRNA進入核蛋白體的受位，并促進移位過程。釋放因子（RF）是與多肽鏈合成終止有關(guān)的蛋白因子。其作用主要是識別mRNA上的終止密碼，協(xié)助多肽鏈的釋放。三、三種RNA

（一）mRNA（messengerRNA）

——

蛋白質(zhì)生物合成的直接模板DNAmRNA蛋白質(zhì)★

mRNA是遺傳信息的攜帶者順反子：遺傳學(xué)將編碼一個多肽的遺傳單位。單順反子：真核生物中，一條mRNA鏈只能為一種蛋白質(zhì)編碼

。這種mRNA稱為單順反子。多順反子：原核生物中，一條mRNA鏈往往為功能相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)編碼。這種mRNA被稱為多順反子?！?/p>

mRNA分子中每三個相鄰堿基組成一個密碼子，代表一種氨基酸，或起始信號，或終止信號?！?/p>

mRNA上的四種堿基可組成64(43)個密碼子，

其中61個代表不同的氨基酸，其余三個代表終止信號。

通用遺傳密碼子遺傳密碼的特點：（1）通用性：從簡單生物到人類使用同一套密碼子。由此可推測所有生物來源于一個共同的祖先。（2）方向性：

mRNA中密碼子的閱讀方向是5′→3′。（3）簡并性：除Met，Trp外，其余氨基酸由2個以上密碼子編碼。同義密碼子（但每一個密碼子僅對應(yīng)一個氨基酸）

生物學(xué)意義：保證屬的穩(wěn)定性。（4）連續(xù)性：密碼子的排列是連續(xù)的，不間隔，也不重疊。5′….UCACGACAUAUG….3′5′….UCAGCGACAUAUG….3′絲精組蛋絲丙蘇酪5′….UCAGACAUAUG….3′絲天異亮☆

移碼突變是最嚴(yán)重的突變！插入缺失（5）起始密碼子與終止密碼子：

起始密碼子：AUG，GUG，UUC。

終止密碼子：UAA，UGA，UAG。（6）擺動性

密碼子與反密碼子配對，有時會出現(xiàn)不遵從堿基配對規(guī)律的情況，稱為遺傳密碼的擺動現(xiàn)象。AUC123I

U

GAC

U

AG

UC

反密碼子第一位堿基密碼子第三位堿基密碼子反密碼子配對的擺動現(xiàn)象氨基酸臂反密碼子環(huán)（二）tRNA（transferRNA）

—蛋白質(zhì)生物合成的

“高級搬運工”

tRNA分子上與多肽合成有關(guān)的位點有4個：（1）3-端-CCA上的氨基酸接受位點。（2）識別氨酰-tRNA合成酶的位點。（3）核糖體識別位點．使延長中的肽鏈附著于核糖體上。（4）反密碼子位點。tRNA的功能：

特定的tRNA搬運特定的氨基酸，保證了遺傳信息傳遞的準(zhǔn)確性。

活化氨基酸，跨越能障，使肽鍵的形成變得容易。

將密碼子信息轉(zhuǎn)換為對應(yīng)氨基酸的符號——接合體，接合器，適配器等。即tRNA能與專一的氨基酸結(jié)合并識別mRNA分子上的密碼子?！?/p>

tRNA搬運功能的忠實性是通過以下兩條途徑實現(xiàn)的：★

tRNA的反密碼子識別mRNA的密碼子?！锎竽c桿菌中,與Met特異結(jié)合的tRNA有兩種：tRNAfMet和

tRNAMet◆不同的tRNA有不同的堿基組成，并由不同的氨基酰tRNA合成酶識別。既能識別特異的tRNA，又能識別特異的氨基酸。◆

tRNA上的反密碼子識別mRNA上的密碼子遵循不穩(wěn)定或擺動配對原則。

一種tRNA僅轉(zhuǎn)運一種氨基酸，而一種氨基酸可由幾種tRNA轉(zhuǎn)運ACG5′3′5′3′UGUmRNAtRNA反密碼環(huán)反密碼子的第一堿基密碼子的第三堿基

UA或G

I

U,C或

AGC或U（三）核糖體（ribosome）

——蛋白質(zhì)生物合成的場所（裝配機）▲

組成、結(jié)構(gòu)與功能特點：

結(jié)構(gòu)復(fù)雜而精密

由3種的rRNA（占60%左右）及數(shù)十種蛋白質(zhì)組成。

rRNA起主導(dǎo)作用，蛋白質(zhì)協(xié)助維持rRNA的功能區(qū)域。

轉(zhuǎn)肽酶是RNA而不是蛋白質(zhì)?！M成：大小亞基▲分類：一類附著于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與分泌蛋白的合成；另一類游離于胞質(zhì)，參與細(xì)胞固有蛋白質(zhì)的合成?！δ埽汉颂求w相當(dāng)于裝配機，大亞基有轉(zhuǎn)肽酶活性，促進氨基酸合成肽。

EtEpPAmRNAmRNA結(jié)合位點細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)☆核糖體—蛋白質(zhì)生物合成的場所TA：受位,氨基酰位

P：給位,肽位

T：轉(zhuǎn)肽酶Ep:多肽鏈出口

Et：tRNA出口原核細(xì)胞核糖體及mRNA結(jié)合部位示意圖30S與mRNA結(jié)合部位

肽位結(jié)合或接受肽基的部位受位/氨基酰位結(jié)合或接受AA-tRNA的部位50S53PAT轉(zhuǎn)肽酶mRNA原核生物翻譯過程中核蛋白體結(jié)構(gòu)模式:

A位：氨基酰位

E位：排出位

P位：肽酰位四、參與合成的其他組分1.供能物質(zhì)：ATP、GTP

2.無機離子：Mg++K+多核蛋白體：一條mRNA上同同時結(jié)合多個核蛋白體進行蛋白質(zhì)多肽鏈合成。第二節(jié)蛋白質(zhì)生物合成過程（翻譯）（以原核為例）

氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運（準(zhǔn)備過程）多肽鏈的形成—核糖體循環(huán)（中心環(huán)節(jié)）分三階段：翻譯起始肽鏈的延長肽鏈合成終止翻譯后加工★氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運（準(zhǔn)備過程）氨基酰-tRNA

合成酶ATPPPiH2N-CH-C-OHR

O

H2N-CH-C-AMP-EROH2N-CH-C~O-ACC-tRNARO氨基酰-tRNA氨基酰-tRNA

合成酶tRNA氨基酸消耗2個高能磷酸鍵氨基酰-AMP-E

氨基酸活化→活化氨基酸的搬運→活化氨基酸與核蛋白體結(jié)合.★

核糖體循環(huán)（中心環(huán)節(jié)）☆定義：活化氨基酸在核糖體上縮合形成多肽鏈的過程?！铍A段劃分：起始階段延長階段：終止階段☆過程：整個過程這三個階段都是在核糖體上完成，所以將此過程稱為廣義的核糖體循環(huán)。進位轉(zhuǎn)肽移位

一、起始階段

起始氨基酰-tRNA與mRNA結(jié)合到核糖體上，形成起始復(fù)合物的過程。

原料：fMet-tRNA，IF(1，2，3)，GTP，Mg2+步驟：核蛋白體大小亞基分離；mRNA在小亞基定位結(jié)合；起始氨基酰-tRNA的結(jié)合；核蛋白體大亞基結(jié)合。

2、小亞基識別并結(jié)合mRNA

mRNA通過5’端S－D序列配對結(jié)合到核蛋白體小亞基上的16S-rRNA近3’-末端處（有一段短序列…UCCU…）。IF-3對此有固定作用。30S50S50S+解聚30S

IF-1IF-3

1、核蛋白體亞基分離起始因子IF3結(jié)合到核糖體(70S)的小亞基上，使大亞基(50S)與小亞基(30S)解離。30SmRNA3、

fMet-tRNAfMet與小亞基結(jié)合fmet-tRNA和IF-2及GTP形成復(fù)合物，只能辨認(rèn)和結(jié)合于mRNA的起始密碼子AUG上。這個過程和mRNA在核蛋白體小亞基就位同時發(fā)生，這一結(jié)合，推動了mRNA的前移，也保證了mRNA就位的準(zhǔn)確性。fMetIF-2，GTPAUGAUGfMet

4、大小亞基聚合

IF-3脫落，在已有mRNA和fMet-tRNA的小亞基上，加入核蛋白體的大亞基，成為一個已準(zhǔn)備好的翻譯系統(tǒng)整體，即翻譯起始復(fù)合物。IF-3GDP+Pi50S起始復(fù)合物fMetAUGfMetAUGIF-1IF-2★真核生物與原核生物核糖體循環(huán)的起始過程的不同點：1.起始Met-tRNAMet不需甲?；?；2.

起始因子不少于10種；3.

小亞基先與Met-tRNAMet結(jié)合，再與mRNA結(jié)合；4.ATP供能。二、肽鏈延長階段：▼根據(jù)mRNA密碼序列的指導(dǎo)，順序添加的氨基酸從N端向C端延伸肽鏈，直到合成終止的過程。▼原料：各種氨基酰-tRNA，EF（Tu,Ts,G），GTP，Mg2+，K+。▼步驟：肽鏈延長在核蛋白體上連續(xù)性循環(huán)式進行，每次循環(huán)增加一個氨基酸，包括以下三步：進位(entrance)又稱注冊(registration)成肽(peptidebondformation)轉(zhuǎn)位(translocation)

1、

進位（又稱注冊）Tu-GDPTu-GTPPiTu-GTP特異的氨基酰-tRNA進入A位pAAUGAUGTu-GTP

指根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導(dǎo)，使相應(yīng)氨基酰-tRNA進入核蛋白體A位。2、轉(zhuǎn)肽（成肽）Mg2+，K+轉(zhuǎn)肽酶CH2CH2-CHOC=

OCH-RNH2O=OCH2NCH3SAUGUAC給受OCO=R-CHNHOHCO=H3CSCH2CH2-CHNH2AUGUAC給受A位成肽后，P位留下空載tRNA轉(zhuǎn)肽酶催化的肽鍵形成過程。OHEFG，GTPAUGA215′→3′OH21AUG5′3′轉(zhuǎn)位酶3、轉(zhuǎn)位（移位）

延長因子EF-G有轉(zhuǎn)位酶活性，可結(jié)合并水解1分子GTP，促進核蛋白體向mRNA的3'側(cè)移動。OHEFG，GTPAUGA215→3′OH21AUG5′3′AUG213AUG312AUG213進位成肽轉(zhuǎn)位成肽N→C延長轉(zhuǎn)位酶通過進位-轉(zhuǎn)肽-移位不斷重復(fù)，肽鏈自N→C端不斷延長

通過進位-轉(zhuǎn)肽-移位不斷重復(fù)，肽鏈自N→C端不斷延長OHEFGGTPOHA

每生成1個肽鍵，要消耗2分子GTP(進位和移位),而氨基酸活化需消耗2個高能磷酸鍵，每增加1個氨基酸殘基實際消耗4個高能磷酸鍵?！镎婧松锱c原核生物核糖體循環(huán)的

肽鏈延長階段的不同點：

1.進位時延長因子是EF-1，

可分為、和三類；

2.移位時延長因子為EF-2，

其活性可被白喉毒素抑制三、終止階段RF-3：促RF-1

或RF-2從核糖體上結(jié)合★

真核生物僅有一個釋放因子：eRF，可

識別三種密碼子,并需GTP參與。RF-1：UAA，UAGRF-2：UAA，UGA

當(dāng)mRNA的任一終止信號進入A位時，沒有任何tRNA能與之識別，只有釋放因子(RF)識別這種信號,進入終止階段.

1、終止密碼子的辨認(rèn)

RF-1或RF-2UAAOCO=R-CHAUAAOCO=R-CHUAARFRF1和

RF2識別終止密碼，進入A位H-OH轉(zhuǎn)肽酶2.肽鏈的水解和脫落

肽鏈從肽酰-tRNA水解出。OHRFCO=R-CHORFR-CHC-OHO=RF3使轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)樗庾饔?，使P位上肽鍵與tRNA之間的酯鍵被水解分離。肽鏈自核蛋白體釋出。3、tRNA、RF、mRNA的釋放，核糖體大小亞基的解聚OHRF-3，IF-3

EF-GRFOHRF

在RF作用下，tRNA、核蛋白體自mRNA上脫落，在IF1作用下，核蛋白體分解為大、小亞基重新進入核蛋白體循環(huán)。廣義的核蛋白體循環(huán)：fMetAUG

1.起始2.肽鏈延長3.終止多核糖體循環(huán)5′3′意義：提高翻譯效率。

在細(xì)胞內(nèi)的翻譯是以多個核蛋白體聚在一起的形式，一條mRNA上可同時合成多條同樣的多肽。合成速度40aa/S

從核蛋白體釋放出的新生多肽鏈不具備蛋白質(zhì)生物活性，必需經(jīng)過不同的翻譯后復(fù)雜加工過程才轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粯?gòu)象的功能蛋白?！锓绞剑海ㄒ唬┣懈?.去除N末端蛋氨酸殘基2.信號肽及其他肽段的切除（二）修飾1.二硫鍵的形成2.輔助因子的連接和亞基聚合3.多肽鏈中個別氨基酸的修飾（三）新生肽鏈的折疊

第三節(jié)

翻譯后加工一、一級結(jié)構(gòu)的修飾

原核生物（一）肽鏈N-端和C-端的修飾去除N末端蛋氨酸殘基脫甲酰基酶Met-fMet-氨基肽酶真核細(xì)胞（二）部分氨基酸的共價修飾

1．羥基化膠原蛋白前體的賴氨酸、脯氨酸殘基羥基化是成熟膠原形成鏈間共價交聯(lián)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。

2．磷酸化細(xì)胞內(nèi)信號分子的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。。

3．糖基化多肽鏈中某些天冬酰胺殘基的酰胺氮、絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基可以與寡糖鏈以共價鍵連接而使多肽鏈糖基化。

4．二硫鍵形成某些分泌型蛋白質(zhì)常常形成鏈內(nèi)二硫鍵，以維系和穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。

（三）剪接加工

某些無活性蛋白質(zhì)前體可經(jīng)蛋白酶水解，生成具有活性的蛋白質(zhì)或多肽，如胰島素原被酶解而生成胰島素，多種蛋白酶原經(jīng)裂解激活成蛋白酶。另外，真核細(xì)胞某些大分子多肽前體，經(jīng)翻譯后加工，水解生成數(shù)種小分子活性肽類。胰島素的前體胰島素切去C肽段C肽段A肽段B肽段（二）修飾

1.二硫鍵的形成CysSHCysSHCysSCysS-2H二硫鍵異構(gòu)酶等二、空間結(jié)構(gòu)的修飾

1．亞基的聚合

如血紅蛋白通過非共價鍵將亞基聚合成寡聚體。2．輔基的連接

如糖蛋白、脂蛋白、各種酶等，合成后需與輔基連接，才具有活性。3．疏水脂鏈的共價連接

如Ras蛋白、G蛋白等需嵌入疏水雙層膜脂，才具有活性。三、新生肽鏈的折疊（folding）★蛋白質(zhì)的生物活性不僅依賴于他們的氨基酸

順序，而且依賴于他們的空間結(jié)構(gòu)?！镄律逆湵匦杞?jīng)過一系列嚴(yán)格而復(fù)雜的折疊過程，才能形成具有正確空間結(jié)構(gòu)的有活性的蛋白質(zhì)。★多肽鏈的氨基酸順序如何決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)——第二遺傳密碼？——

中心法則研究中有待解決的重大問題新生肽鏈的折疊

需要分子伴侶和折疊酶類的參與★分子伴侶（molecularchaperone）：

幫助新生肽鏈進行非共價折疊的一類蛋白質(zhì)。如：熱休克蛋白，前導(dǎo)肽等★折疊酶（foldase）類：催化與折疊直接有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)的酶。目前只有兩個：1.二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)，

2.

脯氨酰異構(gòu)酶(PPI)。分子伴侶幫助新生肽鏈正確折疊分子伴侶新生肽鏈正確折疊的蛋白質(zhì)錯誤折疊的蛋白質(zhì)

第四節(jié)蛋白質(zhì)生物合成與醫(yī)學(xué)的關(guān)系◆疾病總是與蛋白質(zhì)有直接或間接

的聯(lián)系?！粢缘鞍踪|(zhì)生物合成為靶點可用于治療某些疾病。★分子病★蛋白質(zhì)合成的阻斷劑一、分子病

☆定義：由于基因的異常引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列的異常，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能異常，由此造成的疾病稱為分子病。☆病例：

鐮刀形紅細(xì)胞性貧血☆發(fā)病的分子機制：

鏈第6位氨基酸被替換DNA：…CTT……CAT…

mRNA：…GAA…

…GUA…

蛋白質(zhì)：…

Glu…

谷氨酸

…Val…

纈氨酸

谷氨酸被纈氨酸替換后，使血紅蛋白易形成纖維沉淀，使紅細(xì)胞易聚集且易溶血。（一）影響肽鏈起始的抗生素

抗生素

機理

靶點四環(huán)素族阻礙氨基酰tRNA與小亞基結(jié)合小亞基

鏈霉素抑制翻譯起始；使讀碼錯誤小亞基卡那霉素

氯霉素抑制轉(zhuǎn)肽酶活性，阻止肽鍵形成大亞基

嘌呤霉素代替氨基酰tRNA進入受位，大亞基使肽鏈合成過早終止。

放線菌素特異抑制真核生物轉(zhuǎn)肽酶活性大亞基二、抗生素對蛋白質(zhì)合成的影響

抗生素(antibiotics)是微生物產(chǎn)生的能夠殺滅或抑制細(xì)菌的一類藥物。氯霉素嘌呤霉素放線菌酮鏈霉素和卡那霉素四環(huán)素族（二）影響肽鏈延長的抗生素

1.干擾進位的抗生素

四環(huán)素和土霉素特異性結(jié)合原核生物小亞基的A位，抑制氨基酰-tRNA進位。2．引起讀碼錯誤的抗生素

氨基糖苷類抗生素（鏈霉素）能結(jié)合于30S亞基解碼部位的附近區(qū)域，嚴(yán)重影響翻譯的準(zhǔn)確性。3．影響肽鍵形成的抗生素

氯霉素可結(jié)合核糖體，阻止由轉(zhuǎn)肽酶催化的肽?；c氨基酰基之間肽鍵的形成；紅霉素能與核糖體亞基中肽鏈排出通道結(jié)合，阻止新生肽鏈從核糖體大亞基中排出，從而阻止肽鍵的進一步形成。4．影響轉(zhuǎn)位的抗生素

夫西地酸、硫鏈絲菌肽和細(xì)球菌素阻止核糖體循環(huán)中的轉(zhuǎn)位過程。大觀霉素結(jié)合核糖體，阻礙小亞基變構(gòu)抑制轉(zhuǎn)位反應(yīng)。三、干擾蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)（一）毒素(toxin)

1.白喉毒素：抑制哺乳類動物的延長因子EFT2的活性。

2.蓖麻蛋白蓖麻蛋白是蓖麻籽中所含的植物糖蛋白，由A、B兩條多肽鏈組成。A鏈?zhǔn)且环N蛋白酶，可使真核生物核糖體大亞基的

rRNA降解，使核糖體大亞基失活；B鏈對A鏈發(fā)揮毒性具有重要促進作用。（二）干擾素(interferon)

病毒感染宿主后，細(xì)胞產(chǎn)生一類蛋白因子，它抑制病毒的繁殖保護宿主

第五節(jié)基因工程一、基因工程及相關(guān)概念1.DNA重組

不同來源的DNA分子可以通過磷酸二酯鍵連接形成重新組合的DNA分子，稱為DNA重組。2.基因工程

實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程,又稱重組DNA工藝學(xué)。是在基因水平上操作并改變生物遺傳性的技術(shù)。3.限制性核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切核酸酶就是識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。二、基因工程的主要步驟（一）目的基因的獲取概念：目的基因是指為某一特定目的所需要的

DNA片段，又稱為目的DNA。方法：1、基因組DNA文庫

2、制備cDNA文庫

3、PCR4、化學(xué)合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。（二）基因載體的選擇與構(gòu)建★基因載體是指運載目的基因進入宿主細(xì)胞進行擴增和表達的DNA分子?！锍Ｓ没蜉d體：

1.質(zhì)粒

存在于細(xì)胞染色體外的環(huán)狀小分子雙鏈

DNA。

2.噬菌體

是感染細(xì)菌的一類病毒

3.粘粒是將噬菌體與質(zhì)粒組合的裝配型載體。

4.病毒

結(jié)構(gòu)簡單，易改造和操作，轉(zhuǎn)染率較高，理想的載體。★基因工程的目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。（三）目的基因與載體的連接

將目的基因插入載體，用DNA連接酶連接雙鏈DNA粘性末端序列，在體外重新連接成人工重組體。方法主要有以下四種：

1．粘性末端連接2．同聚物加尾連接3．平末端連接4．人工接頭連接

（四）重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

常用的方法有以下兩種：1.轉(zhuǎn)化(transformation)

將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。2.感染(infection)

以噬菌體進入宿主菌或病毒進入宿主細(xì)胞中繁殖的過程。（五）重組體的篩選

1、遺傳學(xué)方法針對載體攜帶有某種或某些標(biāo)志基因和目的基因而設(shè)計的篩選方法。

2、分子雜交法