第三章發(fā)酵液預處理

第三章

發(fā)酵液預處理目的不僅在于分離細胞、菌體和其它懸浮顆粒（細胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物），還希望除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后繼各步操作。采用絮凝或凝聚的方法，設法增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速度；或采用稀釋、加熱等方法降低黏度，以利于過濾。第一節(jié)發(fā)酵液的預處理一、發(fā)酵液過濾特性的改變微生物發(fā)酵液的特性為：發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%，懸浮液中大部分是水；懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。微生物發(fā)酵液的成分極為復雜，其中除了所培養(yǎng)的微生物菌體及殘存的固體培養(yǎng)基外，還有未被微生物完全利用的糖類、無機鹽、蛋白質(zhì)，以及微生物的各種代謝產(chǎn)物。改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學方法：調(diào)酸（等電點）、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質(zhì)、添加反應劑、冷凍-解凍及添加助濾劑等。1.降低液體粘度

2.調(diào)整pH3.凝聚與絮凝

根據(jù)流體力學原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度（加水稀釋法和加熱法等）可有效提高過濾速率。注意加熱溫度與時間，不影響產(chǎn)物活性和細胞的完整性。pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。氨基酸、蛋白質(zhì)等電點的調(diào)節(jié)；在膜過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染；細胞、細胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。凝聚——指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象；絮凝——指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序為：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3（1）凝聚

發(fā)酵液中的細胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。

采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子（如---COOH）或陽離子（如---NH2）基團以及不帶電荷的非離子型基團。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。（2）絮凝高分子絮凝劑的吸附和絮凝作用示意圖1）有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常見的高分子聚合物絮凝劑有機合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）類衍生物根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為三類：非離子型陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：聚丙烯酰胺絮凝劑聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應謹慎。聚丙烯酰胺類絮凝劑的應用醫(yī)藥和食品工業(yè)：聚丙烯酸類陰離子絮凝劑（無毒），聚苯乙烯類衍生物，無機高分子聚合物絮凝劑（聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等），天然有機高分子絮凝劑（多聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等）。影響絮凝的因素絮凝劑的加量(圖3-1）絮凝劑的分子量溶液的pH攪拌速度攪拌時間對于帶負電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機理；對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。（3）混凝4.加入助濾劑5.加入反應劑

一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，改變了濾餅結(jié)構(gòu)，降低了過濾阻力。常用的助濾劑有：硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。使用硅藻土時，通常細粒用量為500g/m3；中等粒度用量為700g/m3；粗粒用量為700-1000g/m3。加入反應劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過濾性能；如發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）雜蛋白在采用離子交換提煉時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。

因此，在預處理時，應盡量除去這些物質(zhì)。二、發(fā)酵液的相對純化（一）、高價無機離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡合物；Fe2+——黃血鹽，→普魯士藍沉淀（二）雜蛋白的去除方法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負電荷。在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點。1.沉淀法在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成沉淀。2.變性法

加熱大幅度調(diào)節(jié)pH值加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。不足之處加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會導致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法第二節(jié)固液分離工程及設備重力沉降浮選旋液分離過濾離心通氣，產(chǎn)生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。用于固液比重差小、直徑5～30μm顆粒的分離，污水處理懸浮液以較高速度沿切線方向進入旋液分離器，輕相由分離器中央排出，重相由分離器下部排出，但不適合直徑<5μm顆粒去除（可用絲網(wǎng)分離器）。工業(yè)上常用霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發(fā)酵液采用過濾方法；細菌和酵母菌為單細胞，體形較小，其發(fā)酵液采用高速離心分離，如對發(fā)酵液進行預處理，也可用過濾進行固液分離。一、固液分離的方法優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：設備投資高、能耗大。離心機種類：碟片式離心機、管式離心機、傾析式離心機。1.離心分離在液相非均一系統(tǒng)中，利用離心力達到液－液、液－固、液－液－固分離的方法，統(tǒng)稱為離心分離。碟片式離心機

是傳統(tǒng)離心機，為目前工業(yè)上應用最廣泛的離心機。分離因數(shù)可達1000-20000，最大處理量達到300m3/h，常用于大規(guī)模的分離過程。適用范圍

細菌、酵母菌、放線菌、細胞碎片卸料方式的不同而分類1，人工排渣適用：固相濃度很低，液液分離，同時除去少量固體；澄清作業(yè)工業(yè)實例：提取抗生素

生產(chǎn)疫苗

收集梭狀芽孢桿菌

生物素

生物堿類化合物2，噴嘴排渣

適用：多用于濃縮過程，濃縮比可達5-20300m3/h

顆粒直徑：0.1-100微米

體積濃度:<10%的懸浮液3，活塞排渣利用活門啟閉排渣孔進行斷續(xù)自動排渣。位于轉(zhuǎn)鼓底部的環(huán)板狀活門在操作時可上下移動，位置在上，關(guān)閉排渣口，停止卸料。下降時開啟排渣口，因此排渣時可以不停機。最大處理能力：40m3/h適合處理直徑0.1-500微米，固液密度差大于0.01g/m3，固相含量小于10%的懸浮液。活門排渣碟片離心機是近年新開發(fā)的機型，可使速率增加23%-30%,故可使分離因數(shù)達15000左右，這是其他碟片離心機所不能及的。管式離心機

管式離心機是一種分離效率很高的離心分離設備，其轉(zhuǎn)鼓細長，可在15000-50000的高轉(zhuǎn)速下工作，分離因數(shù)可達104-6×105。它設備簡單、操作穩(wěn)定。適用范圍

細胞、細胞碎片、細胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等。特別適合一般分離機難以分離的固形物含量<1%發(fā)酵液的分離。管式離心機工作原理圖GF型，用于分離各種乳濁液,特別適用于二相相對密度差甚微的液一液分離以及含有少量雜質(zhì)的液一液一固分離。分離原理：密度大的液相形成外環(huán)，密度輕的液相形成內(nèi)環(huán)，流體到轉(zhuǎn)鼓上部各自的排液口排出，微量固體沉積在轉(zhuǎn)鼓壁上，待停機后人工卸出。GQ型，用于分離各種難于分離的懸浮液。特別適合于濃度小、粘度大，固相顆粒細，固液重度差較小的固液分離。分離原理：密度較大的固體微粒逐漸沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁形成沉渣層，待停機后人工卸出，澄清后的液相流動轉(zhuǎn)鼓上部的排液口排出。傾析式分離機

是一種靠離心力和螺旋的推動力作用自動連續(xù)排渣的離心機。具操作連續(xù)、適應性強、結(jié)構(gòu)緊湊和維修方便的優(yōu)點。分離因數(shù)為1500-3000。適用范圍

特別適合固形物含量較多的懸浮液的分離。因分離因數(shù)較低，不適合細菌、酵母等微小微生物懸浮液的分離。（P53圖）可以在高溫高壓下操作，也可用于催化劑的回收。2過濾

定義：

在一定的壓力差下，利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法稱為過濾。

通常發(fā)酵液的黏度大，其中的微生物體積小，造成過濾的困難。在過濾前，一般需對料液進行絮凝或凝聚等預處理，此外可添加助濾劑提高過濾速度。A.根據(jù)過濾機理，過濾操作可分為澄清過濾和濾餅過濾。澄清過濾：過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒等，當懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，適合于固體含量少于0.1g/100ml、顆粒直徑在5-100μm的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。過濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。當濾餅至一定厚度時即起過濾作用，此時即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾，在濾餅過濾中，懸浮液本身形成的濾餅起著主要的過濾作用，適合于固體含量大于0.1g/100ml的懸浮液的過濾分離。濾餅過濾：2.1過濾介質(zhì)的選擇作用技術(shù)特性工業(yè)上常用的過濾介質(zhì)（1）織物介質(zhì)：濾布天然纖維濾布和合成纖維濾布

具有應用廣泛，過濾性能受諸多因素影響，最主要的是纖維的特性，編織紋法和線型。

（2）粒狀介質(zhì)/助濾劑：硅藻土、細砂、活性炭、白土、和淀粉（3）多孔固體介質(zhì)：多孔陶瓷，多孔玻璃，多孔塑料B.常用過濾設備廣泛應用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。（1）板框過濾機板框過濾機板框過濾機1.結(jié)構(gòu)：若干板，框交替排列，板，框都用支耳架在一對橫梁上，用壓緊裝置壓緊或拉開。2.濾板結(jié)構(gòu)：凹凸紋路作用支撐濾布，提供濾液或洗滌液的流道。分為洗滌板和非洗滌板兩種。3.濾框結(jié)構(gòu)：有供料漿通過的暗孔，料漿在壓差的推動下籍框兩側(cè)覆蓋的濾布進行過濾分離。4.過濾操作液體流動路徑：料漿沿1通道輸入，通過濾框的暗孔進入濾框，框中的料漿在壓差的推動下籍框兩側(cè)覆蓋的濾布進行過濾分離。濾餅在框內(nèi)兩側(cè)生成并增長，濾液通過濾布流到濾板板面的凹槽后因板面凹槽有暗孔與2、4通道相連或與3通道相連，故濾液可由三條通道流到過濾機外。優(yōu)點：

真空轉(zhuǎn)鼓過濾機具有自動化程度高、操作連續(xù)、處理量大。特別適合固體含量大（>10％）的懸浮液的分離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母發(fā)酵液或細胞懸浮液的過濾分離。缺點：

由于受真空度的限制，不適于菌體較小和粘度較大的細菌發(fā)酵液的過濾，且過濾所得固相的干度