豬卵透明帶3α重組乳桿菌疫苗的研發(fā)制造,免疫學(xué)論文

豬卵透明帶3α重組乳桿菌疫苗的研發(fā)制造,免疫學(xué)論文免疫避孕是一種生育期婦女節(jié)育的重要措施。常見(jiàn)的免疫避孕抗原有卵細(xì)胞外表抗原、精子外表抗原、人絨毛膜促性腺激素和生殖激素等，這些抗原可能干擾生育期婦女的生殖系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)，誘發(fā)生殖功能紊亂、免疫失調(diào)、本身免疫性疾病等疾病，因而尚需研究新型疫苗。乳桿菌〔Lactobacillus〕是一種革蘭陽(yáng)性的無(wú)芽胞需氧菌，一般呈細(xì)長(zhǎng)的桿狀，大小為〔0.5~1〕m〔2~10〕m.常成雙或短鏈狀排列。常見(jiàn)菌株有干酪乳桿菌〔L.casei〕、嗜酸乳桿菌〔L.acidophilus〕、植物乳桿菌〔L.plantarum〕和約氏乳桿菌〔L.johnsonii〕等，常用于食品和飼料加工業(yè)，在功能食品、醫(yī)療保健和微生態(tài)制劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的疫苗載體[1~3],本研究擬就乳桿菌介導(dǎo)的豬卵透明帶3抗原和人絨毛膜促性腺激素疫苗的構(gòu)建及其作用機(jī)制等方面的研制現(xiàn)在狀況進(jìn)行綜述。1大腸埃希菌-乳桿菌穿梭載體的構(gòu)建乳桿菌的細(xì)胞壁厚而且復(fù)雜，攝取外源DNA較為困難，Kim等[4]用電穿孔方式方法進(jìn)行外源DNA轉(zhuǎn)化乳桿菌的試驗(yàn)，并探索出了較好的轉(zhuǎn)化條件，這為構(gòu)建重組乳桿菌疫苗提供了有利條件。為了將外源DNA有效引入乳桿菌，需構(gòu)建大腸埃希菌-乳桿菌穿梭表示出載體，乳桿菌的穿梭表示出載體通常有組成型和誘導(dǎo)型兩種類型。Guchte等[5]構(gòu)建的pMG36e是一種常見(jiàn)的組成型表示出載體。它含有p32啟動(dòng)子及其下游部分的開(kāi)放閱讀框、來(lái)自pUC18的多克隆位點(diǎn)和來(lái)自PrtP基因的轉(zhuǎn)錄終止子、pWV01的復(fù)制子和氯霉素抗性基因等。盡管該載體可表示出高水平的外源蛋白，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的富集和聚合卻可導(dǎo)致蛋白在胞質(zhì)中被降解，通常對(duì)細(xì)胞具有毒害作用。誘導(dǎo)型表示出載體可利用誘導(dǎo)劑對(duì)外源蛋白進(jìn)行可控性表示出，因此應(yīng)用較為廣泛。Ruyter等[6]開(kāi)發(fā)了乳菌肽控制的表示出系統(tǒng)〔nisin-controlledexpressionsystem,NICE〕.該系統(tǒng)含有3個(gè)組分：攜帶nisR和nisK基因的宿主菌、充當(dāng)誘導(dǎo)分子的乳菌肽〔Nisin〕以及含有nisA啟動(dòng)子的質(zhì)粒。誘導(dǎo)劑Nisin誘導(dǎo)ni-sA啟動(dòng)子，nisA啟動(dòng)子由nisR和nisK組成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。nisK是Nisin的膜結(jié)合感應(yīng)蛋白，nisR是膜內(nèi)反響調(diào)節(jié)子。nisK接受外源nisin肽信號(hào)后，本身磷酸化激活胞漿內(nèi)nisR,隨后nisR激活nisA啟動(dòng)子，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表示出。宿主菌NZ3900含有nisK和nisR基因，質(zhì)粒pNZ8149含有nisA啟動(dòng)子，其起始密碼子ATG處有NCOI酶切位點(diǎn)，這樣使插入的目的基因與nisA啟動(dòng)子的核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域構(gòu)成翻譯融合，較轉(zhuǎn)錄融合具有更高層次的表示出活性。通常將含有nisA啟動(dòng)子的質(zhì)粒導(dǎo)入攜帶nisR和nisK蛋白的宿主菌時(shí)，外源基因的表示出較弱，當(dāng)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期參加nisin進(jìn)行誘導(dǎo)后，外源基因的表示出水平在一定范圍內(nèi)與nisin的劑量成正比，誘導(dǎo)效率能夠到達(dá)1000倍以上[7].乳桿菌的表示出載體既能夠利用胸苷酸合成酶〔thymidylatesynthase,Thy〕或丙氨酸消旋酶〔alanineracemase,Alr〕的營(yíng)養(yǎng)缺陷型作為選擇標(biāo)記，可以以利用乳糖或木糖作為選擇標(biāo)記。這些標(biāo)記均可食用，對(duì)于口服疫苗的開(kāi)發(fā)極具價(jià)值。人們發(fā)現(xiàn)thyA基因編碼的Thy在DNA合成中起關(guān)鍵作用，缺失thyA基因的菌株在普通培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，alr基因編碼的Alr是很多細(xì)菌生長(zhǎng)的必需成分。Fu等[8]以干酪乳桿菌來(lái)源的thyA基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建了食品級(jí)載體pFXL103,Bron等[9]將含異源alr基因的質(zhì)粒pGIPO11轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌alr-菌株后，alr-菌株恢復(fù)了野生型表型。Platteeuw等[10]構(gòu)建了食品級(jí)穿梭表示出載體pLP3537,它含有l(wèi)acF選擇標(biāo)記、高拷貝內(nèi)源性的乳酸乳球菌pSH71復(fù)制子、lacA啟動(dòng)子和PepN終止子，配套菌株為刪除了lacF基因的乳酸乳球菌NZ3900株，能夠利用乳糖作為選擇標(biāo)記。將pLP3537質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LacF基因缺失的宿主菌NZ3900株后，可使原來(lái)不能利用乳糖的宿主菌NZ3900發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸，使pH降低，使挑選培養(yǎng)基中的溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，這種利用乳糖為選擇標(biāo)記的表示出系統(tǒng)的元件都是食品級(jí)的，口服具有安全性。Gosalbes等[11]構(gòu)建了乳糖調(diào)節(jié)的乳酸桿菌食品級(jí)表示出載體pILac.戊糖乳球菌的MD353染色體上含有木糖〔xylose,xy1〕編碼基因，能夠發(fā)酵木糖。Posno等[12]把xy1基因插入pLP3537,得到食品級(jí)表示出載體pLP3537-xyl,能夠利用木糖作為選擇標(biāo)記，這些選擇標(biāo)記的成功開(kāi)發(fā)為發(fā)展乳桿菌成為疫苗載體提供了有力的保障。2豬卵透明帶3重組乳桿菌疫苗豬卵透明帶3抗原〔porcinezonapellucid3，PZP3〕是一種分子量為73kDa的糖蛋白，包被于卵母細(xì)胞和著床前胚胎的外表，是一種精子特異性受體，在精卵結(jié)合和其后引發(fā)的精子頂體反響中起主要作用。Martinez等[13]將重組PZP3蛋白接種鼠猴獲得了較好的避孕效果，提示它是一種有效的受精前免疫避孕靶抗原。熊亞明等[14]以pVAX1-PZP3為模板擴(kuò)增900bp的PZP3編碼基因，插入pILac-SP得pILac-PZP3；將其電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌CECT5276株，培養(yǎng)48h,免疫印漬發(fā)現(xiàn)兔抗PZP3的血清辨別重組菌表示出的分子量為55kDa的PZP3蛋白，表示清楚該疫苗可表示出具有生物活性的PZP3蛋白。3人絨毛膜促性腺激素重組乳桿菌疫苗3.1人絨毛膜促性腺激素人絨毛膜促性腺激素〔humanchorionicgonadotropinbeta-subunit,hCG〕是人體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的妊娠特有激素，可維持并刺激妊娠黃體產(chǎn)生孕酮，促進(jìn)蛻膜細(xì)胞發(fā)育成熟，是一種受精后免疫避孕的靶抗原。Talwar等[15]將hCG制劑接種受試婦女可誘導(dǎo)hCG抗體，一旦hCG抗體濃度到達(dá)50ng/mL的水平常即可誘導(dǎo)很好的避孕效果。Kahala等[16]發(fā)現(xiàn)短小乳桿菌的S-層蛋白A〔S-layerproteinA,SLPA〕是一種分子量為40kDa的信號(hào)蛋白，可有效引導(dǎo)外源蛋白在乳桿菌的分泌表示出。王紅梅等[17,18]以pBS-hCG為模板擴(kuò)增hCG編碼基因，與SLPA的編碼基因連接后，插入pILac得pILac-hCG；將其電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌CECT5276株，0.5%乳糖誘導(dǎo)21h,SDS證實(shí)重組菌表示出分子量為22kDa的hCG蛋白；將108CFU疫苗經(jīng)陰道接種BALB/c鼠1次，在初次免疫后2周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的陰道沖洗液sIgA升高〔滴度1∶12800〕,提示該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一個(gè)有效的黏膜免疫應(yīng)答。姚曉英等[19~21]以短小乳桿菌的基因組DNA為模板擴(kuò)增90bp的SLPA編碼基因，以pBS-hCG為模板擴(kuò)增495bp的hCG編碼基因，將SLPA與hCG的編碼基因連接后插入pILac得pILac-hCG；將其電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌CECT5276株，培養(yǎng)8h,免疫印漬發(fā)現(xiàn)兔抗hCG的血清辨別重組菌表示出的分子量為22kDa的hCG蛋白；將109CFU疫苗經(jīng)陰道注入BALB/c鼠，在初次免疫后3周加強(qiáng)1次，在初次免疫后5周發(fā)現(xiàn)陰道沖洗液sIgA升高，在初次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾細(xì)胞明顯增殖，并分泌高水平的IFN-和IL-4等細(xì)胞因子，放免試驗(yàn)證實(shí)陰道沖洗液hCG水平在初次免疫后24~35d升高，在初次免疫后28d達(dá)較高水平〔濃度15MIU/mL〕;同時(shí)將1010CFU疫苗經(jīng)陰道接種和灌胃分別免疫BALB/c鼠和C57BL/6鼠，在初次免疫后3周加強(qiáng)1次，在初次免疫后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾細(xì)胞明顯增殖，在初次免疫后4~8周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的子宮和陰道沖洗液均存在IgG分泌細(xì)胞以及IgA分泌細(xì)胞，提示該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一個(gè)有效的黏膜和體液免疫應(yīng)答。3.2hCG-C3d3Dempsey等[22]以為補(bǔ)體片段C3d可增加靶抗原的免疫原性，C3d3是3個(gè)拷貝的C3d,與抗原共價(jià)結(jié)合后可選擇性加強(qiáng)宿主的體液免疫應(yīng)答。姚曉英等[23,24]以phCMV1-hCG-C3d3為模板擴(kuò)增hCG-C3d3的編碼基因，插入pILac得pI-Lac-hCG-C3d3;將其電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌CECT5276株，0.5%乳糖誘導(dǎo)24h,SDS證實(shí)重組菌表示出分子量為220kDa的hCG-C3d3融合蛋白；將1010CFU疫苗經(jīng)陰道分別接種BALB/c鼠和C57BL/6鼠，在初次免疫后3周加強(qiáng)1次，在初次免疫后2~8周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清和陰道沖洗液IgG和IgA升高，脾、子宮和陰道的淋巴細(xì)胞增殖，陰道和子宮的抗體分泌細(xì)胞的數(shù)目顯著增加，提示該疫苗同樣可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一個(gè)有效的黏膜和體液免疫應(yīng)答。El-Hefnawy等[25]發(fā)現(xiàn)MLTC-1細(xì)胞株是小鼠睪丸間質(zhì)腫瘤細(xì)胞系，可表示出hCG受體，在hCG刺激下可分泌孕酮。Wice等[26]證實(shí)Bewo細(xì)胞株是人絨癌細(xì)胞系，具有自發(fā)融合的生物學(xué)作用，可在體外模擬體內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化融合經(jīng)過(guò)。王健理等[27]將1010FU重組菌LL〔pILac-hCG-C3d3〕滴鼻免疫BALB/c鼠，在初次免疫后3周加強(qiáng)1次，在初次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清可抑制hCG刺激的MLTC-1細(xì)胞株分泌孕酮，抑制Bewo細(xì)胞株分泌hCG以及Bewo細(xì)胞株融合，提示該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生具有生物活性的hCG抗體。4結(jié)語(yǔ)乳桿菌具有下述優(yōu)點(diǎn)：它是一種發(fā)酵工業(yè)長(zhǎng)期使用的食品級(jí)益生菌，是一種公以為安全〔generallyregardedassafe,GRAS〕的微生物，易培養(yǎng)，基因操作簡(jiǎn)便可靠，轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好；乳桿菌是一種革蘭陽(yáng)性菌，不分泌內(nèi)毒素，表示出的外源蛋白不需純化，可連同菌體直接服用；乳桿菌通常不產(chǎn)生細(xì)胞外蛋白酶，不會(huì)在細(xì)胞外對(duì)分泌的外源蛋白進(jìn)行降解；乳桿菌通常較少分泌本身蛋白，減少了載體本身蛋白對(duì)分泌的外源蛋白的干擾；外源蛋白既可在細(xì)胞內(nèi)表示出，可以在細(xì)胞壁進(jìn)行表示出，還能夠分泌到細(xì)胞外進(jìn)行表示出；乳桿菌通常具有免疫佐劑、固有免疫原性和對(duì)膽汁酸的抵抗力，可在胃腸道定植，在胃腸道的微生態(tài)平衡中具有重要作用。乳桿菌與微顆粒疫苗的大小類似，可將抗原遞呈給腸黏膜組織的M細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；口服或滴鼻接種乳桿菌可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的黏膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。乳桿菌具有下述缺點(diǎn)：當(dāng)前大部分乳桿菌表示出載體常含有非食品級(jí)的基因片段，這會(huì)給乳桿菌作為活菌微生態(tài)制劑帶來(lái)安全隱患；尚未說(shuō)明乳桿菌疫苗誘導(dǎo)小腸產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答的機(jī)制；尚未說(shuō)明乳桿菌疫苗的表示出調(diào)控機(jī)制；長(zhǎng)期口服乳桿菌疫苗并不能在宿主體內(nèi)表示出足量的抗原；長(zhǎng)期低劑量口服乳桿菌疫苗有可能誘導(dǎo)免疫耐受；乳桿菌疫苗的效果評(píng)價(jià)僅限于體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)階段。隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)一步挑選高表示出能力的菌株可提高外源蛋白的表示出水平；針對(duì)不同的蛋白表示出方式采用不同的免疫途徑可提高重組乳桿菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；深切進(jìn)入研究乳桿菌分泌外源蛋白的調(diào)控機(jī)制；構(gòu)建安全高效的食品級(jí)表示出載體；準(zhǔn)確定位外源蛋白在乳桿菌中的表示出位置，使重組抗原與黏膜的免疫系統(tǒng)充分接觸；實(shí)時(shí)定量檢測(cè)重組乳桿菌在宿主胃腸道表示出的目的蛋白；合理控制重組乳桿菌在胃腸道的存活時(shí)間，避免免疫耐受；開(kāi)發(fā)適宜的免疫佐劑加強(qiáng)重組乳桿菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。相信隨著這些問(wèn)題的說(shuō)明，將乳桿菌介導(dǎo)的免疫避孕疫苗用于生育期婦女的節(jié)育指日可待。以下為參考文獻(xiàn)[1]XUYi-gang,CUILi-chun.ProgressonLacticacidbacteriaasgeneengeneeringbacteria[J].ChinJMicrobiol,2007,19〔1〕:118-120.〔inChinese〕徐義剛，崔麗春。乳酸菌作為基因工程受體菌的研究瞻望[J]中