單核增生李斯特氏菌檢測概述

單核增生李斯特氏菌

檢測概述2010.11.27內(nèi)容簡介李斯特氏菌屬單核增生李斯特氏菌生物學(xué)特性流行病學(xué)致病性實(shí)驗(yàn)室危害及其預(yù)防檢測程序快速檢測方法李斯特氏菌屬李斯特氏菌屬（Listeria）普遍存在于環(huán)境中，最新的分類學(xué)研究表明，其分為六個(gè)種：單核增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）綿羊（伊氏）李斯特氏菌（Listeriaivanovii）英諾克（無害）李斯特氏菌（Listeriainnocua）斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeriawelshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeriagrayi）

在李斯特氏菌屬的六個(gè)種中，只有兩種致病菌：單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他動物發(fā)病。但是，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥（listeriosis）相關(guān)。因此，李斯特氏菌中最有檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。生物學(xué)特性

---菌體形態(tài)及染色特征革蘭氏陽性；小的、類似球形桿菌，0.4~0.5×0.5~2μm，在有些培養(yǎng)基中稍彎，兩端鈍圓，單個(gè)、成短鏈、細(xì)胞彼此連成V形，或成群的細(xì)胞沿長軸方向平行排列，在較老的或生長不良的培養(yǎng)物中，可能形成絲狀；20-25℃周生鞭毛運(yùn)動，在37℃只有較少的鞭毛或1根鞭毛；無芽孢、無莢膜。生物學(xué)特性

---培養(yǎng)特性兼性厭氧；在20--25℃培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)2-5天可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運(yùn)動。生長溫度范圍為2-42℃（也有報(bào)道在0℃能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為30--37℃。pH范圍pH4.4-pH9.6。生物學(xué)特性

---培養(yǎng)特性在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的β-溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)瓊脂上，用45°角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。生物學(xué)特性

---生化反應(yīng)氧化酶陰性。能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗(yàn)和精氨酸水解陽性。生物學(xué)特性

---血清型根據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個(gè)血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”。致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。生物學(xué)特性---抵抗力該菌對理化因素抵抗力較強(qiáng)，在土壤、糞便、青儲飼料和食品中能長期存活；對堿和鹽抵抗力強(qiáng)，60-70℃經(jīng)5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min可殺死此菌；濕熱滅菌（121℃，至少15min）和干熱滅菌（160-170℃，至少1hr）可殺滅該菌，對紫外線和γ射線敏感；該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素（已產(chǎn)生抗性）、氨基糖苷類、氯霉素均敏感。流行病學(xué)

分布：廣泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、廢水、青儲飼料、動植物及其食品中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進(jìn)行傳播寄主范圍：哺乳動物、鳥類、魚類、甲殼類和昆蟲流行病學(xué)

據(jù)報(bào)道，有1-10%的人類腸道中存在單核增生李斯特氏菌，4-8%的水產(chǎn)品、5-10%的奶及其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。相關(guān)食品：鮮奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是軟奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、發(fā)酵過的生肉制作的香腸、生的和加工過的禽肉、各種生的肉類、生的和煙熏的魚肉。約有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。致病性及其治療該病的臨床表現(xiàn)，健康成人個(gè)體出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)或死嬰、腦膜炎、敗血癥直至死亡。由該菌造成的腦膜炎的致死率可高達(dá)70%，敗血癥的死亡率達(dá)50%，圍產(chǎn)期或新生兒感染的死亡率超過80%，懷孕期婦女的感染，母親通常能存活下來。抗生素治療，用青霉素或氨芐青霉素注射給藥，或與氨基糖苷類抗生素一起用藥。感染人群感染劑量未知，但與該菌的毒力和易感人群的年齡、免疫狀態(tài)有關(guān)。易感者：孕婦/胎兒—圍產(chǎn)期和新生兒的感染；接受皮質(zhì)激素、抗癌劑治療、器官移植治療、艾滋病患者等免疫缺損者；癌癥病人—尤其是白血病的患者；不太常見的報(bào)道—糖尿病、肝硬化、哮喘和潰瘍性結(jié)腸炎的患者；年紀(jì)較大的人；沒有免疫缺陷的健康的人，食用污染該菌尤其是大量污染該菌的食品后，也有患病的危險(xiǎn)。致病機(jī)理單增李氏菌的抗原結(jié)構(gòu)與毒力無關(guān)，它的致病性與毒力機(jī)理如下：1、寄生物介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)增生，使它附著及進(jìn)入腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞；2、抗活化的巨噬細(xì)胞，單增李氏菌有細(xì)菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)的過氧物（為殺菌的毒性游離基團(tuán)）分解；3、溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，有α和β兩種，為毒力因子。實(shí)驗(yàn)室危害不是一種普遍的與實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的傳染病，目前只有少數(shù)有報(bào)道的案例發(fā)生；直接攝取是最普遍的一種感染方式，除此之外，暴露在該菌高濃度的氣溶膠中，也可通過眼睛和破損的皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)造成感染。注意事項(xiàng)生物安全2級，操作時(shí)應(yīng)有相應(yīng)的防污染設(shè)施，在進(jìn)行可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時(shí)，應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成；在直接接觸有感染性的材料時(shí)，必須穿著實(shí)驗(yàn)服，戴手套和護(hù)目鏡；懷孕的婦女應(yīng)避免接觸傳染物。操作要求濺灑：使氣溶膠沉降，穿著防護(hù)服裝，用紙巾輕輕覆蓋濺灑處，加入1%次氯酸鈉溶液，由周邊向中心加，在清理之前要留充足的接觸時(shí)間（30min）；廢棄：在廢棄前應(yīng)先采取凈化措施，高壓蒸汽滅菌、化學(xué)消毒、焚燒等；儲存：在有適當(dāng)標(biāo)記的密封容器內(nèi)儲存。25g樣品+225mlFB1增菌液30℃25h±1h1mL轉(zhuǎn)種10mLFB2增菌液30℃25h±1hVIDAS快速篩選陰性，報(bào)告結(jié)果陽性，繼續(xù)鑒定選擇性培養(yǎng)基（顯色培養(yǎng)基、OXA、PALCAM）

挑選可疑菌落，接種TSA-YE35℃24h接種TSB-YE藍(lán)色菌落檢驗(yàn)典型運(yùn)動檢驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)革蘭氏染色溶血試驗(yàn)動力試驗(yàn)協(xié)同溶血試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)

報(bào)告結(jié)果單核增生李斯特氏菌檢測流程（SN/T0184.1-2005）

API鑒定試驗(yàn)或生化試驗(yàn)?zāi)蛩孛杆?，硝酸鹽還原，葡萄糖，甘露醇，麥芽糖，鼠李糖，木糖，七葉苷，TSIMR-VP---增菌目前常用的單核增生李斯特氏菌檢測增菌肉湯主要有半量Fraser肉湯、Fraser肉湯（FB）、UVM（ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1）、LEB（Listeriaenrichmentbroth）和BLEB（bufferedListeriaenrichmentbroth）半量Fraser肉湯和Fraser肉湯具有選擇性和區(qū)別性。加入檸檬酸鐵銨和七葉靈，起到區(qū)別的作用。李斯特氏菌可以水解七葉靈，與培養(yǎng)基中的鐵離子反應(yīng)，使培養(yǎng)基變黑，可直觀的從培養(yǎng)液的顏色就可以判斷是否有單核李斯特氏菌的生長。氯化鋰、吖啶黃和萘啶酮酸作為選擇性因子。半量Fraser肉湯與Fraser肉湯所用的添加劑一樣半量Fraser肉湯：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黃12.5mg/LFraser肉湯：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黃的25mg/LUVMUVM只有選擇性沒有區(qū)別性加入萘啶酮酸和鹽酸吖啶黃，作為選擇性因子。雖然其中含有七葉靈，但是沒有添加檸檬酸鐵銨，不能發(fā)生黑色的顏色反應(yīng)。LEB和BLEB只有選擇性沒有區(qū)別性LEB是在TSB-YE的基礎(chǔ)上加入鹽酸吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮等選擇性因子；加入的丙酮酸鈉，有助于受損細(xì)胞的恢復(fù)；不含七葉靈和檸檬酸鐵銨，無顏色反應(yīng)BLEB是在LEB基礎(chǔ)上加入緩沖體系：磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉檢測程序

---分離分離培養(yǎng)基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等。分離原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培養(yǎng)基中的七葉靈，產(chǎn)生七葉苷，與鐵離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)而使菌落為棕褐色，并帶有褐色暈圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能發(fā)生這種反應(yīng)還有一些選擇性顯色培養(yǎng)基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是檢測由毒力基因編碼的溶血素，而此種溶血素只存在于單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的將此兩種菌同李斯特屬的其他種分開。OXA平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培養(yǎng)OXA平板無害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培養(yǎng)顯色平板12h24h檢測程序

---鑒定藍(lán)色菌落檢驗(yàn)（Henryillumination）典型運(yùn)動：相差顯微鏡，輕微旋轉(zhuǎn)或翻跟頭動力試驗(yàn)：7天，傘形生長過氧化氫酶試驗(yàn)：陽性革蘭氏染色：陽性短桿菌溶血試驗(yàn)：穿刺接種血平板硝酸鹽還原試驗(yàn)：5天，陰性糖發(fā)酵試驗(yàn)：葡萄糖、麥芽糖和七葉靈，李斯特菌屬反應(yīng)均為陽性，除格氏李斯特甘露醇陰性，李斯特其他種甘露醇陰性，木糖和鼠李糖最有檢測意義動力試驗(yàn)血平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培養(yǎng)血平板無害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培養(yǎng)血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培養(yǎng)單增李斯特菌無害李斯特菌綿羊李斯特菌馬紅球菌金葡協(xié)同溶血試驗(yàn)單核增生李斯特氏菌檢測流程(GB/T4789.30-2010)檢樣25g(或25mL)樣品+LB1增菌液225mL，均質(zhì)0.1mL+10mLLB2增菌液李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基PALCAM瓊脂接種木糖、鼠李糖，36±1℃，24h；同時(shí)于TSA-YE平板劃線純化，30±1℃，24h~48h木糖-，鼠李糖+鑒定結(jié)果報(bào)告30±1℃，24h30±1℃，18~24h36±1℃，24h~48h單核增生李斯特氏菌檢測流程(FDA)25g樣品+225mlBLEB基礎(chǔ)（加入丙酮酸鈉）

加入萘啶酮酸、鹽酸吖錠黃、放線菌酮30℃4hr劃線接種OXA平板30℃

24hr和48hr

科瑪嘉李氏菌顯色培養(yǎng)基TSA-YE分純35℃

24hr-48hr

35℃

24hr過氧化氫酶試驗(yàn)、革蘭氏染色、溶血試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)（木糖、鼠李糖）APIListeria35℃

24-48hr報(bào)告結(jié)果35℃18-24hr25g樣品+225mlFB1增菌液30℃25h±1h1mL轉(zhuǎn)種10mLFB2增菌液30℃25h±1hVIDAS快速篩選陰性，報(bào)告結(jié)果陽性，繼續(xù)鑒定選擇性培養(yǎng)基（顯色培養(yǎng)基、OXA、PALCAM）

挑選可疑菌落，接種TSA-YE35℃24h接種TSB-YE藍(lán)色菌落檢驗(yàn)典型運(yùn)動檢驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)革蘭氏染色溶血試驗(yàn)動力試驗(yàn)協(xié)同溶血試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)

報(bào)告結(jié)果單核增生李斯特氏菌檢測流程（SN/T0184.1-2005）

API鑒定試驗(yàn)或生化試驗(yàn)?zāi)蛩孛杆?，硝酸鹽還原，葡萄糖，甘露醇，麥芽糖，鼠李糖，木糖，七葉苷，TSIMR-VP方法名稱一次增菌二次增菌分離鑒定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）藍(lán)色菌落；典型運(yùn)動；過氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗(yàn)；尿素酶試驗(yàn)；硝酸鹽還原；MR-VP；三糖鐵；糖發(fā)酵；動力試驗(yàn)；協(xié)同溶血*；血清學(xué)檢驗(yàn)*；小鼠毒力試驗(yàn)*無未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-2003EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）藍(lán)色菌落；三糖鐵；動力試驗(yàn)；染色鏡檢（革蘭氏染色、典型運(yùn)動）；生化特性（溶血反應(yīng)、硝酸鹽還原、尿素酶、MR-VP、糖發(fā)酵）；小鼠毒力試驗(yàn)；協(xié)同溶血無LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三種抑菌劑（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七葉靈+Fe3+推薦BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria藍(lán)色菌落*；典型運(yùn)動或動力試驗(yàn)；過氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗(yàn)；硝酸鹽還原*；糖發(fā)酵；協(xié)同溶血；血清學(xué)檢驗(yàn)；小鼠毒力試驗(yàn)*篩選、鑒定都可以使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步鑒定：純菌菌落形態(tài)；典型運(yùn)動；生化鑒定：MICRO-ID?

Listeria或Api?

Listeria或BAM等方法中的傳統(tǒng)生化反應(yīng)；協(xié)同溶血遺傳鑒定：核糖體RNA檢測；PFGE*篩選用的快速方法必須經(jīng)過確認(rèn)后才可使用鑒定中用到MICRO-ID?、Api?、GenProbeAccuProbe?、GENE-TRAK?各官方方法比較各官方方法比較方法名稱一次增菌二次增菌分離鑒定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM典型運(yùn)動或動力試驗(yàn)；溶血試驗(yàn)；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速鑒定試劑盒*；過氧化氫酶*；革蘭氏染色*；協(xié)同溶血*；血清學(xué)試驗(yàn)*作為鑒定的可選步驟，允許使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe?ISO11290-1:1996（E）半量Fraser肉湯（30℃，24±2h）Fraser肉湯（35或37℃，48±2h）OXA和PALCOM（30、35或37℃，24-48h，）PALCOM平板微需氧或好氧條件培養(yǎng)藍(lán)色菌落*；過氧化氫酶；革蘭氏染色；動力試驗(yàn)或典型運(yùn)動*；溶血試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；協(xié)同溶血；送參考實(shí)驗(yàn)室（血清或噬菌體分型）無NMKLNo.1362nd1999LBⅠ（30.0±1.0℃，24±3h）LBⅡ（30.0±1.0℃，24±3h）或Fraser肉湯（37.0±1.0℃，48±4h）OXA和PALCOM（37.0±1.0℃，24±3/48±4h，好氧或微需氧）溶血試驗(yàn)；過氧化氫酶；革蘭氏染色；典型運(yùn)動動力試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；送參考實(shí)驗(yàn)室（血清、噬菌體、DNA或酶分型）允許使用經(jīng)過確認(rèn)的商業(yè)化生產(chǎn)的單核增生李斯特氏菌菌株鑒定試驗(yàn)，但沒列明具體試劑盒名稱FDA：李斯特氏菌屬的快速篩選試劑盒Table2.

ListeriaGenusDetectionTestKitsPrescribedforRegulatoryScreeningAOACOfficialMethod993.09.2000.Listeriaindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricdeoxyribonucleicacidhybridizationmethod(GENE-TRAKListeriaAssay).(3,14)AOACOfficialMethod994.03.2000.Listeriamonocytogenesindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricmonoclonalenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod(ListeriaTek).(5,15,32)AOACOfficialMethod995.22.2000.Listeriainfoods.Colorimetricpolyclonalenzymeimmunoassayscreeningmethod(TECRAListeriaVisualImmunoassay[TLVIA]).(6,30)AOACOfficialMethod996.14.2000.Assurance(PolyclonalEnzymeImmunoassayMethod).(7,21)AOACOfficialMethod997.03.2000.VisualImmunoprecipitateAssay(VIP).(8,22)AOACOfficialMethod999.06.2000.EnzymeLinkedImmunofluorescentAssay(ELFA)VIDASLISAssayScreeningMethod.(9,23)FDA：生化鑒定的替代方法VitekAutomicrobicGramPositiveandGramNegativeIdentificationcards(bioMerieux,Hazelwood,MO)APIListeria(bioMerieux,Marcy-l'Etoile,France)whichdoesnotrequireanadditionalCAMPtestTheMICRO-IDTMkit(bioMerieux,Hazelwood,MO;1,24)permitsspeciationofListeriaisolatesiftheirCAMPreactionsareknownThePhenotyp