色譜分析基礎(chǔ)

色譜分析法

Chromatography1.國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的定義

Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationaryphasewhiletheothermovesinadefinitedirection.一、色譜法概述CaCO3Petroleumether茨維特Experiment色譜法是一種基于物理作用的分離方法。它的特點(diǎn)是：物質(zhì)在兩相中分配，一是固定相，一是流動(dòng)相，兩相作相向運(yùn)動(dòng)。

色譜法創(chuàng)始人

——俄國(guó)植物學(xué)家Tswett色譜的歷史色譜法的發(fā)展1906年Tswett發(fā)明色譜的研究方法1954年Martin色譜塔片理論1958年，Giddings毛細(xì)管氣相色譜1960年代，高效液相色譜1980年代，超臨界流體色譜1990年代，大規(guī)模制備色譜：生命科學(xué)2000年代，多維色譜，超高壓色譜，快速制備：蛋白質(zhì)組學(xué)，藥物研發(fā)Paperchromatography(PC),紙色譜法Thinlayerchromatography(TLC),薄層色譜法Ionexchangechromatography(IEC，IC),離子交換色譜法Gelpermeationchromatography(sizeexclusion,GPC),

凝膠色譜法，體積排阻色譜法Affinitychromatography(AC)，親和色譜法Gaschromatography(GC),氣相色譜法Supercriticalfluidchromatography(SFC)，超臨界流體色譜法Highperformanceliquidchromatography(HPLC),高效液相色譜法Capillary(Zone)electrophoresis(CE),毛細(xì)管電泳HighSpeedCountercurrent

Chromatography（HSCCC）2.常用的色譜分析方法術(shù)語(yǔ)3.色譜法的分類按流動(dòng)相的狀態(tài)分類氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜按固定相的使用形態(tài)分類柱色譜紙色譜薄層色譜按分離機(jī)理分類：吸附、分配、離子交換、空間排阻……色譜新分類法按分子間相互作用類型：一非特異相互作用色譜疏水相互作用離子作用：離子交換，離子排斥（道南效應(yīng)）和離子對(duì)親水相互作用……二特異相互作用-親和色譜免疫親和固定化金屬親和硼親和仿生親和（分子印跡聚合物、適配體、仿生材料）……

4.各種色譜方法的應(yīng)用（1）薄層色譜法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便分離速度快（適合多個(gè)樣品的同時(shí)測(cè)定）樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單對(duì)被分離物質(zhì)的性質(zhì)沒(méi)有限制直觀、可比HPTLC用于人參、三七和西洋參的鑒別最重要的應(yīng)用領(lǐng)域：藥物分析，如中國(guó)藥典中的TLC鑒別（2）氣相色譜法用于分離分析易汽化、穩(wěn)定、不易分解、不易反應(yīng)的樣品特別適合用于同系物、同分異構(gòu)體的分離分離效率高（3）高效液相色譜法用于分離分析高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。分離效率高于TLC分離機(jī)理多，應(yīng)用范圍廣人參的HPLC譜圖超臨界流體色譜用于齊聚物分析（4）超臨界流體色譜超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時(shí)，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。超臨界流體色譜(SFC)，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):（1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。（5）毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳用于DNA測(cè)序以毛細(xì)管為分離通道以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力依據(jù)樣品中各組分之間電泳速度和分配行為上的差異生命科學(xué)、藥物分析、以及從小分子、離子到單細(xì)胞分析電色譜的基本原理和操作結(jié)合毛細(xì)管電泳的高柱效和高效液相色譜的高選擇性色譜柱為填充了HPLC填料的填充型毛細(xì)管柱和管內(nèi)壁涂漬了固定相功能分子的開(kāi)管毛細(xì)管柱以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力分離機(jī)理包含有電泳遷移和色譜固定相的保留機(jī)理，溶質(zhì)與固定相間的相互作用對(duì)分離起主導(dǎo)作用。CEC與質(zhì)譜聯(lián)用既可解決LC/MS的分離效率不高的問(wèn)題，又可克服CE/MS中質(zhì)量流量太小的缺陷。主要應(yīng)用在藥物、手性化合物和多環(huán)芳烴的分離分析。電色譜分離酸性化合物二、色譜理論基礎(chǔ)色譜常用術(shù)語(yǔ)色譜峰相關(guān)保留值相關(guān)分離效能評(píng)價(jià)相關(guān)peakPeakheightBaselinePeakwidthPeakwidthathalfheightPeakareaStandarderror:σ色譜流出曲線（chromatogram）:

指樣品注入色譜柱后，信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線。RetentiontimeDeadtimeσ=0.607h處峰寬的一半W1/2=2.355σW=4σ=1.70W1/2基線:無(wú)組分通過(guò)色譜柱時(shí)，檢測(cè)器的噪音隨時(shí)間變化的曲線。保留時(shí)間:進(jìn)樣到出現(xiàn)色譜峰的時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間死體積：色譜柱的空隙體積保留體積：進(jìn)樣到出現(xiàn)色譜峰時(shí)消耗的流動(dòng)相體積調(diào)整保留體積：扣除死體積后的保留體積相對(duì)保留值：在相同的操作條件下，組分與參比組分的調(diào)整保留值之比分配系數(shù)K（distributioncoefficient）：一定溫度與壓力下兩相達(dá)平衡后，組分在固定相和流動(dòng)相濃度的比值容量因子k（retentionfactor，capacityfactor)：一定溫度與壓力下兩相達(dá)平衡后，組分在固定相和流動(dòng)相量的比值相比β（phaseratio）：色譜柱中流動(dòng)相與固定相相體積之比理論塔板數(shù)（柱效）n（Numberoftheoreticalplates

）K=CS/CM

k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0)/t0選擇性因子αSeparationfactor）：相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比分離度R（Resolutionfactor）：相鄰色譜峰保留時(shí)間之差的兩倍與兩色譜峰峰基寬之和的比值

R<1.0 兩峰明顯重疊R=1.0 兩峰達(dá)97.7%分離R1.5 兩峰完全分開(kāi)R=0.59R’α與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無(wú)關(guān)。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。

2色譜理論基礎(chǔ)色譜熱力學(xué)理論試樣在兩相間分配色譜動(dòng)力學(xué)理論組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)，峰寬與傳質(zhì)關(guān)系塔板理論速率理論色譜熱力學(xué)理論分子間作用力：色散力、誘導(dǎo)力、取向力、氫鍵氣相色譜：溶質(zhì)與固定相間液相色譜：溶質(zhì)與固定相、流動(dòng)相間重要熱力學(xué)參數(shù)分配系數(shù)K容量因子k保留值熱力學(xué)方程GC：溫度；HPLC:洗脫強(qiáng)度K=CS/CM

分配系數(shù)K與柱中固定相和流動(dòng)相的體積無(wú)關(guān)，而取決于組分及兩相的性質(zhì)，并隨柱溫、柱壓變化而變化。容量因子k決定于組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)，隨柱溫、柱壓的變化而變化，還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0)/t0（1）塔板理論目的——從理論上得到描述色譜流出曲線的方程，并通過(guò)這一方程各參數(shù)來(lái)研究影響分離的因素。假設(shè) （1）色譜柱存在多級(jí)塔板;

（2）組分通過(guò)時(shí)在每級(jí)塔板兩相間達(dá) 到一次平衡;色譜動(dòng)力學(xué)理論r——塔板數(shù)N——轉(zhuǎn)移次數(shù)設(shè)：有A、B兩組分，kA=2 kB=1/2當(dāng)N=0 r=0A組分在兩相分配達(dá)平衡后：流動(dòng)相分量=固定相分量=r0r1r2。。。。。。。。rn下表列出經(jīng)過(guò)各級(jí)轉(zhuǎn)移后組分在每一級(jí)塔板中的量：色譜流出曲線方程c:流動(dòng)相流過(guò)體積v時(shí)柱出口組分濃度；m為進(jìn)樣量；b為與塔板高度、柱長(zhǎng)、容量因子等有關(guān)的參數(shù)V=VR時(shí)，mcmax

由于所獲得的流出曲線在N很大時(shí)呈正態(tài)分布，因此可將流出曲線方程轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布方程形式：將此方程與標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布曲線方程比較：可知：所以：或：根據(jù)：所以：n稱為色譜柱的理論塔板數(shù)。 因?yàn)閠R是熱力學(xué)常數(shù)，當(dāng)色譜柱的長(zhǎng)度一定，理論板數(shù)目n越大，色譜峰越窄。（2）速率理論概述速率理論是1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等提出，因此又稱作范第姆特方程。運(yùn)用流體分子規(guī)律研究色譜過(guò)程中產(chǎn)生色譜峰擴(kuò)展的因素，導(dǎo)出了理論塔板高度與流動(dòng)相線速度的關(guān)系，揭示了影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素。

氣相色譜中速率方程的導(dǎo)出根據(jù)塔板計(jì)算公式：

n=5.54(tR/W1/2)2速率理論討論的是色譜峰展寬原因，即影響塔板數(shù)n的因素，也就是影響塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu渦流擴(kuò)散項(xiàng)A=2λdp渦流擴(kuò)散項(xiàng)均勻性因子粒徑

渦流擴(kuò)散項(xiàng)A

由不等路徑造成的色譜峰擴(kuò)展。由于柱填料粒徑大小不同，粒度分布范圍不一致及填充的不均勻，形成寬窄、長(zhǎng)短不同的路徑，因此流動(dòng)相沿柱內(nèi)各路徑形成紊亂的渦流運(yùn)動(dòng)，有些溶質(zhì)分子沿較窄且直的路徑運(yùn)行，以較快的速度通過(guò)色譜柱，發(fā)生分子超前，反之，有些分子發(fā)生滯后，從而使色譜峰產(chǎn)生擴(kuò)散。

分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u項(xiàng)其中B=2γDg彎曲因子擴(kuò)散系數(shù)

分子擴(kuò)散項(xiàng)

由于分子的縱向擴(kuò)散造成的色譜峰擴(kuò)展。即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運(yùn)動(dòng)著的分子產(chǎn)生縱向擴(kuò)散，引起色譜峰擴(kuò)展。

傳質(zhì)阻力項(xiàng)由氣相傳質(zhì)阻力和液相傳質(zhì)阻力兩項(xiàng)組成

氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cgu

試樣組分從氣相移動(dòng)到固定相表面的過(guò)程中，由于質(zhì)量交換過(guò)程需要一定時(shí)間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過(guò)程中，部分組分分子隨流動(dòng)相向前運(yùn)動(dòng)，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴(kuò)展。

容量因子

液相傳質(zhì)阻力項(xiàng)CLu

試樣組分從固定相表面移動(dòng)到固定相內(nèi)部的過(guò)程中，由于質(zhì)量交換過(guò)程需要一定時(shí)間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過(guò)程中，部分組分分子先離開(kāi)固定相表面，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴(kuò)展。

液相擴(kuò)散系數(shù)液膜厚度

速率方程給我們的什么啟示？為柱型的研究和發(fā)展提供理論依據(jù)為操作條件的選擇提供理論指導(dǎo)為色譜柱的填充提供理論指導(dǎo)對(duì)柱型研究和發(fā)展的影響（1）A=0?Golay1957年提出毛細(xì)管柱的概念（opentube）毛細(xì)管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分離能力大大提高液體作流動(dòng)相時(shí)可用更細(xì)的固定相，A↓對(duì)柱型研究和發(fā)展的影響（2）B=0?溶質(zhì)在液體中的擴(kuò)散系數(shù)DL≈10-5cm2/s溶質(zhì)在氣體中的擴(kuò)散系數(shù)Dg≈10-1cm2/sDL《Dg當(dāng)采用液體作流動(dòng)相時(shí)

B→0載氣線速度（流速）的影響最佳流速：u=(B/C)1/2實(shí)用最佳流速：比最佳流速更快A與流速無(wú)關(guān)B/u：當(dāng)流速小時(shí)，對(duì)H的大小起主導(dǎo)作用Cu：當(dāng)流速大時(shí)，對(duì)H的大小起主導(dǎo)作用操作條件對(duì)柱效的影響（1）H-u曲線容量因子k的影響不同組分k不同，測(cè)出的柱效不同在氣相傳質(zhì)阻力相中，k↑

，Cg↑理論上說(shuō)k越小柱效越高，實(shí)際不可取在液相傳質(zhì)阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓當(dāng)k=1時(shí)，最大。希望k在一個(gè)合適的范圍內(nèi)，通過(guò)改變柱溫、固定相、柱型參數(shù)等可實(shí)現(xiàn)。柱溫的影響間接