微生物耐藥基礎(chǔ)與臨床之真菌耐藥監(jiān)測

真菌耐藥監(jiān)測

真菌概述臨床真菌學(xué)抗真菌藥物真菌耐藥機(jī)制真菌耐藥監(jiān)測真菌Fungus一大類真核細(xì)胞型微生物。細(xì)胞核高度分化，有核膜和核仁，胞漿內(nèi)有完整的細(xì)胞器。細(xì)胞壁由纖維素、幾丁質(zhì)或葡聚糖組成，不含肽聚糖。含葉綠素，無根、莖、葉的分化。從外界獲取碳源，有性或無性繁殖，行腐生或寄生生活。真菌與動物、植物、細(xì)菌的區(qū)別真菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

fungalcellularstructure細(xì)胞壁cellwall：含幾丁質(zhì)、葡聚糖、甘露聚糖細(xì)胞膜cellmenbrane：含麥角固醇類化合物ergosterol細(xì)胞質(zhì)cytoplasm:完善的細(xì)胞器，其中核糖體ribosome

80S細(xì)胞核：單細(xì)胞真菌

Single-cellfungi：多細(xì)胞真菌Multicellularfungi：兩相性真菌dimorphicfungi：P99根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)分類單細(xì)胞真菌

single-celledfungi酵母菌yeasts酵母菌出芽繁殖Yeastsreproducebybudding酵母菌yeasts類酵母菌yeast-likefungi假菌絲pseudohyphae

孢子sporeBudding出芽繁殖單細(xì)胞真菌

single-celledfungi多細(xì)胞真菌Multi-cellularfungi孢子spore菌絲hypha絲狀菌filamentousfungus或霉菌molds菌絲的形態(tài)有助于真菌菌種鑒定厚膜孢子、關(guān)節(jié)孢子和大分生孢子的形態(tài)有助于真菌菌種鑒定二相性真菌單細(xì)胞型：酵母菌多細(xì)胞型：絲狀菌機(jī)體內(nèi)寄生37℃含動物蛋白培養(yǎng)基沙保培養(yǎng)基25℃普通培養(yǎng)基25℃真菌的檢驗(yàn)方法鏡檢真菌形態(tài)真菌分離培養(yǎng)與鑒定：真菌抗原檢測真菌核酸檢測真菌代謝產(chǎn)物檢測免疫學(xué)檢測動物實(shí)驗(yàn)臨床標(biāo)本直接檢查直接鏡檢核酸檢測分離培養(yǎng)染色標(biāo)本：革蘭染色墨汁負(fù)染色法乳酸酚棉蘭染色法熒光染色法菌絲型沙氏培養(yǎng)基病理組織標(biāo)本真菌的檢驗(yàn)程序不染色標(biāo)本KOH法動物試驗(yàn)檢測抗原檢測抗體37℃觀察菌落酵母型25℃小培養(yǎng)鏡檢生化反應(yīng)皮膚、指（趾）甲、毛發(fā)：血液腦脊液、胸腹水、膿液等口咽、痰、泌尿生殖道標(biāo)本（注意避開正常菌群的污染?。。。?/p>

淺部真菌感染：皮屑、指（趾）甲、毛發(fā)深部真菌感染：痰、血液、腦脊液、分泌物一、標(biāo)本的采集二、標(biāo)本的直接檢查1.不染色標(biāo)本的檢查：觀察孢子和菌絲。

取皮膚癬屑、感染的毛發(fā)、指趾甲+10%~20%KOH溶液（使角質(zhì)軟化）+蓋玻片：鏡下觀察觀察孢子和菌絲。

菌絲孢子2.染色標(biāo)本的檢查1）革蘭氏染色：

真菌比細(xì)菌大，直徑5μm以上。真菌革蘭染色陽性，但著色不均。2）乳酸酚棉蘭染色3）墨汁負(fù)染：4）熒光染色三、真菌的分離培養(yǎng)培養(yǎng)條件：低營養(yǎng)、低溫度（淺部真菌，20~28℃，深部真菌為37℃）、低pH(4.0-6.0)、高濕度和氧培養(yǎng)基：

Sabouraud沙保培養(yǎng)基酵母型真菌菌落類酵母型真菌菌落菌落：濕潤、柔軟而致密，形態(tài)似一般細(xì)菌菌落絲狀菌落四、真菌的鑒定形態(tài)學(xué)檢測及代謝試驗(yàn)動物接種病理組織檢查免疫學(xué)檢查核酸檢測真菌抗原測定真菌代謝產(chǎn)物檢測假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基真菌抗原測定隱球菌抗原乳膠凝集法檢測新型隱球菌病患者的莢膜多糖抗原GM試驗(yàn)（半乳甘露聚糖）：陽性提示曲霉感染

*半乳甘露聚糖是曲霉細(xì)胞壁的成分G試驗(yàn)（β-D葡聚糖）:陽性提示真菌感染*β-D葡聚糖是多種真菌細(xì)胞壁的成分G試驗(yàn)無特異性，不能確定種屬

G試驗(yàn)不能檢測接合菌（毛霉、根霉）和隱球菌淺部感染真菌Superficialfungi

引起皮膚表面真菌病、表皮真菌病、皮下真菌病causesuperficialmycoses，cutaneousmycoses,subcutaneousmycoses深部感染真菌Systemic（Deep）fungi

引起深部真菌病deepmycoses按感染的部位分類ClassificationBasedonSite淺部真菌感染侵犯皮膚角蛋白組織（表皮角質(zhì)層、毛發(fā)，甲板），引起癬病淺部真菌分：皮膚癬菌和角層癬菌感染源：接觸患者、患畜或染菌物品是指除表皮、毛發(fā)、甲床真菌感染以外侵犯內(nèi)臟、皮下組織、皮膚(角質(zhì)層以下)和粘膜的真菌引起的感染深部真菌感染的病原主要可分為致病性真菌－如組織胞漿菌、球孢子菌、類球孢子菌、皮炎芽生菌、著色真菌、足分支菌、孢子絲菌等，感染多呈地區(qū)性流行條件致病性真菌－如念珠菌、隱球菌、曲菌、毛霉菌、放線菌、奴卡菌等屬，在防御免疫功能低下者易獲感染深部真菌感染口腔白假絲酵母菌（1000×）外陰白假絲酵母菌（1000×）臨床真菌感染現(xiàn)況隨著移植、腫瘤和免疫缺陷患者的增多，侵襲性真菌感染（Invasivefungalinfections，IFI）越來越多IFI：系指真菌侵入人體組織、血液，并在其中生長繁殖引致組織損害、器官功能障礙、炎癥反應(yīng)的病理改變及病理生理過程。IFI的病原菌主要包括假絲酵母菌、曲霉常見的真菌病曲霉菌病假絲酵母病新生隱球菌病淺部真菌?。浩つw癬菌病真菌毒素中毒常見的抗真菌藥物的作用機(jī)制及其耐藥性

抗真菌藥物按作用機(jī)制分類

1.作用于真菌細(xì)胞壁：

2.作用于真菌細(xì)胞膜：

3.作用于真菌核酸：4.作用于真菌蛋白質(zhì)合成：5.其他：大蒜新素、冰醋酸、中草藥1）作用于真菌的細(xì)胞壁：真菌細(xì)胞壁中含有甘露聚糖、幾丁質(zhì)、葡聚糖等主要成分作用于1，3－β－D－葡聚糖合成酶類抗真菌藥物：棘白菌素類藥物作用于真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的藥物：多氧菌素D和尼可霉素Z和X研究中的作用于真菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的其他抗真菌藥物：棘白菌素類抗真菌藥物抑制真菌細(xì)胞壁β-(1,3)-D-葡聚糖的合成而干擾細(xì)胞壁合成目前有卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈3個品種。對于念珠菌，曲霉等均有良好的抑制活性，對于一些雙相真菌如組織胞漿菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等也有抑制作用，但是對于新生隱球菌、鐮刀菌、接合菌和白吉利毛孢子菌等無抑制活性。 不良反應(yīng)較輕微，相對安全棘白菌素類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制細(xì)胞壁的合成障礙:

細(xì)胞生長和形態(tài)改變過程中，細(xì)胞壁的合成和修護(hù)受到嚴(yán)密的調(diào)控，細(xì)胞壁在許多抗真菌藥物的刺激下會產(chǎn)生適應(yīng)性改變而耐藥；在棘白菌素類藥物的作用下，耐藥真菌的部分受體Wsc1和Mid2會介導(dǎo)細(xì)胞壁出現(xiàn)相應(yīng)的反應(yīng)。2）作用于真菌的細(xì)胞膜：多烯類藥物：

兩性霉素B及其酯類制劑吡咯類抗真菌藥：

咪唑類、三唑類烯丙胺類藥物：

鹽酸特比萘芬和鹽酸荼替芬（1）多烯類藥物（polyenes）直接和細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。主要用于深部真菌感染。 包括：兩性霉素B及其三種脂化兩性霉素B、制霉菌素等；兩性霉素B由鏈霉菌產(chǎn)生的抗真菌藥物。抗菌譜廣：念珠菌、隱球菌、組織胞漿菌、酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌屬等有效；部分土曲霉天然耐藥；皮膚和毛發(fā)癬菌通常耐藥。

作用強(qiáng)，耐藥相對較低，是侵襲性真菌感染的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物兩性霉素B優(yōu)點(diǎn)抗真菌譜廣，療效確切，耐藥真菌少，半衰期長(24h)可一日一次用藥缺點(diǎn)蛋白結(jié)合率高>90%血藥濃度相對較低，不進(jìn)入腦脊液，毒性大，不良反應(yīng)多(即刻肝、腎、血液、低鉀、心臟等)

給藥需從小劑量遞增對某些真菌效差或無作用(曲菌、毛霉菌、皮膚、毛發(fā)癬菌)兩性霉素B劑型改進(jìn)兩性霉素B脂質(zhì)體—L-AmB兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合物—ABLC兩性霉素B膠體分散體—ABCD作用：抗真菌作用與兩性霉素B同，腎毒性低適應(yīng)癥：（1）IFI的經(jīng)驗(yàn)及確診治療。（2）無法耐受兩性霉素的患者。（3）腎功能嚴(yán)重?fù)p害不能使用兩性霉素B常規(guī)制劑的患者制霉菌素制霉菌素口服不易吸收，主要用于局部用藥。用于皮膚、膀胱、口腔及陰道等的念珠菌感染,體內(nèi)過程和抗菌作用與兩性霉素B基本相同,但毒性更大且具有不溶解性。制霉菌素脂質(zhì)體減少了毒性,解決了制霉菌素的溶解性問題,開發(fā)前景看好。制霉菌素脂質(zhì)體具有廣譜抗真菌活性,體外試驗(yàn)顯示其可有效對抗一系列真菌菌株,如念珠菌屬、鐮刀菌屬、曲霉菌屬等，對新型隱球菌屬效果明顯,其中某些菌株對現(xiàn)有抗真菌療法耐藥。制霉菌素脂質(zhì)體(Nyotran)多烯類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制通過編碼5，6-甾醇去飽和酶的基因發(fā)生突變，使其細(xì)胞膜中的麥角甾醇結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動性改變，降低了藥物對細(xì)胞膜的親和力。對兩性霉素B耐藥菌的出現(xiàn)頻率仍非常低。通過抑制真菌細(xì)胞色素P450依賴的-羊毛甾醇14α-去甲基化酶作用，導(dǎo)致麥角固醇合成受阻，使真菌的細(xì)胞膜合成受阻，導(dǎo)致真菌細(xì)胞破裂死亡。（2）咪唑類抗真菌藥物吡咯類抗真菌藥包括咪唑類和三唑類衍生物兩大類：咪唑類:

酮康唑、克霉唑、咪康唑和益康唑等（口服吸收差，目前均作為局部用藥）三唑類:

氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑

三唑類藥物氟康唑

伊曲康唑伏立康唑泊沙康唑第一個三唑類抗真菌藥物

第一個對曲霉有效地三唑類抗真菌藥物

抗菌活性進(jìn)一步增強(qiáng)

對接合菌（毛霉）有效1）氟康唑抗菌譜窄,對大多數(shù)念珠菌、隱球菌有效，對曲霉無抑制活性,對克柔念珠菌天然耐藥；2）伊曲康唑較氟康唑抗菌譜寬,并對曲霉有抑制作用；3）伏立康唑較氟康唑抗菌譜寬,并對曲霉、鐮刀菌和其它透明絲孢霉有抑制作用；4）泊沙康唑抗菌譜最寬,對念珠菌,曲霉、鐮刀菌、接合菌和其它透明絲孢有效。 吡咯類藥物耐藥作用機(jī)制改變靶位蛋白與抗真菌藥的親和力：

唑類藥物作用的靶酶是14-α-去甲基化酶，由ERG11基因編碼。ERG11的突變可以改變14-α-去甲基化酶的氨基酸序列，當(dāng)這種改變足以影響酶分子的空間構(gòu)型時，酶分子與藥物分子間的親和力可能被削弱，導(dǎo)致菌株耐藥。由于甾醇去飽和酶的失活使真菌細(xì)胞膜對抗真菌劑的通透性下降，使藥物不能進(jìn)入真菌內(nèi)。真菌對藥物的外排的作用增強(qiáng)，使唑類藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度達(dá)不到有效作用濃度。吡咯類耐藥的多藥耐藥泵多藥泵相關(guān)基因:（CDR1，CDR2）和MDR1的過度表達(dá)有關(guān)MDR1、CDR1、ERG11一定的次序出現(xiàn)：NDR1編碼的mRNA出現(xiàn)于耐藥的早期

EGR11編碼的mRNA出現(xiàn)于耐藥的中后期

CDR1基因編碼的mRNA升高出現(xiàn)于耐藥的后期；（3）丙烯胺類抗真菌藥物抑制角鯊烯環(huán)氧化酶而干擾麥角固醇的生物合成，最終引起細(xì)胞死亡。包括：萘替芬、特比萘芬淺表真菌感染的外用藥物：對皮膚癬菌如發(fā)癬菌（紅色發(fā)癬菌、須瘡癬菌、斷發(fā)癬菌、堇色發(fā)癬菌）、犬小孢子菌和絮狀表皮癬菌有殺菌活性，對念珠菌有抑菌活性。3）作用于真菌核酸合成：5－氟胞嘧啶（5－FC）

灰黃霉素

5－氟胞嘧啶（5－FC）通過真菌細(xì)胞的滲透酶系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)換為氟尿嘧啶，替代尿嘧啶進(jìn)入真菌的脫氧核糖核酸中，從而阻斷核酸的合成。 抗真菌譜窄，僅對酵母菌(新型隱球菌)和酵母樣菌(念珠菌屬)有較高的活性。臨床上很少單獨(dú)使用，常同與其他抗真菌藥物合用

真菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制：（1）真菌細(xì)胞內(nèi)藥物累積減少；（2）藥物靶酶產(chǎn)生增多或靶酶結(jié)構(gòu)改變；（3）靶酶的缺失，導(dǎo)致細(xì)胞代謝途徑的改變；（4）生物被膜形成；（5）細(xì)胞壁的合成障礙；（6）細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。真菌藥物體外敏感試驗(yàn)測定病原真菌對抗真菌藥物的敏感性或者測定抗真菌藥物對病原真菌的抑制活性的體外試驗(yàn)方法方法：稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法體外活性測定指標(biāo)最低抑菌濃度（MIC）：是抑制某種細(xì)菌或真菌生長的最低藥物濃度。常用MIC90和MIC50來描述。

-MIC90是指某種藥物能夠抑制90%被測菌株生長的MIC

-MIC50是指某種藥物能夠抑制50%被測菌株生長的MIC最低殺真菌濃度（MFC,minimum

fugicideconcentration

）

-殺死一定百分比（經(jīng)典殺滅率為90%、98%、99%）真菌的最低藥物濃度。1684210.50.250.125.0625.0313C1C2MIC&MFCMICMFC真菌藥敏試驗(yàn)測定方法肉湯液基稀釋法—CLSIM27-A2，M38-A瓊脂稀釋法紙片擴(kuò)散法—CLSIM44-AE－test法標(biāo)準(zhǔn)化藥敏方法需考慮—培養(yǎng)基菌接種量培養(yǎng)條件/方法藥物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏方法NCCLS（美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會），現(xiàn)已改名臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)是普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)M27－A2酵母菌肉湯稀釋法體外抗真菌藥敏試驗(yàn)參考方法M38－A絲狀真菌肉湯稀釋法體外抗真菌藥敏試驗(yàn)參考方法M44－A酵母菌紙片擴(kuò)散法抗真菌藥敏試驗(yàn)EUCAST標(biāo)準(zhǔn)（EuropeanCommitteeforAntibioticSusceptibilityTesting）肉湯稀釋法可以提供更多的有關(guān)菌體對各種不同抗生素的定量信息，特別是可以給出相關(guān)抗生素的具體的抑菌濃度。

-使用肉湯稀釋法進(jìn)行不同藥物的抗菌活性的檢測時，需將待測菌加到一系列試管中，其中含有定量濃度的經(jīng)倍比稀釋的藥物，如稀釋前的藥物濃度為64ug/ml,其后每次取出前一管體積一半的液體加入等體積的培養(yǎng)基再次進(jìn)行稀釋，即倍比稀釋使藥物含量變?yōu)?2ug/ml,如此反復(fù)。1684210.50.250.125.0625.0313C1C264321684210.50.250.125C1C2倍比稀釋（Two-folddilution）新型隱球菌72小時其余菌株48小時讀取MIC結(jié)果

+紙片擴(kuò)散法是將含有定量抗真菌藥物的紙片置于接種定量真菌的平皿中，在一定溫度下經(jīng)過一定時間孵育后，通過測量抑菌圈的大小來判斷受試真菌對于該藥物的敏感性；該方法簡單直觀，已有商品化試劑；缺點(diǎn)是不能精確量化。瓊脂稀釋法是將一定量的真菌接種于含有不同濃度抗真菌藥物的平皿中，在一定的溫度下經(jīng)過一定時間孵育后，判斷受試真菌對于該藥物的敏感性該方法簡單，但用藥量大，而且難以精確量化，尤其對于抑真菌劑E-test真菌藥敏試條生產(chǎn)商 ABBIODISK，瑞典 原理 屬瓊脂擴(kuò)散法的改良，培養(yǎng)基采用RPMI1640加2%的葡萄糖和1.5%的瓊脂糖，用MOPs調(diào)節(jié)pH到7.0。藥敏紙片采用包被梯度濃度抗真菌藥物的試紙條。 適用范圍念珠菌、隱球菌和絲狀真菌 檢測藥物 包括兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑 MICE-test檢測曲霉的MIC將不同量的抗真菌藥物包被在特殊試劑條上，該方法操作簡單、直觀，與NCCLS法有較好的一致性判斷抗真菌藥敏試驗(yàn)的結(jié)果真菌對抗真菌藥物是敏感還是耐藥的判斷，主要是通過將試驗(yàn)得出的MIC值同確定的藥折點(diǎn)（breakpoint）進(jìn)行比較分析得出，不同藥物的折點(diǎn)有不同的標(biāo)準(zhǔn)，常用的是是由NCCLS/CLSI制定的標(biāo)準(zhǔn)。折點(diǎn)是根據(jù)抗真菌藥物抑制真菌生長所需要的MIC。結(jié)合常用劑量時該藥在人體內(nèi)所能達(dá)到的血藥濃度劃分病原真菌對各種抗真菌藥物敏感和耐藥的界線。是根據(jù)體外試驗(yàn)對藥物在人體的臨床療效作出的預(yù)測。根據(jù)折點(diǎn)判斷結(jié)果敏感(S)耐藥(R)中介(I)劑量依賴性敏感（S-DD）S-DD：Susceptible-DoseDependent劑量依賴性敏感，是指提高給藥劑量后，血液及組織中的藥物濃度仍可高于MIC濃度，即體內(nèi)敏感。判斷抗真菌藥的敏感性和耐藥性NCCLS/CLSI肉湯稀釋法測定念珠菌體外敏感試驗(yàn)的臨界濃度判讀MIC（μg/ml）敏感S劑量依賴性敏感SDD中介I耐藥R氟康唑<=816->=32伊曲康唑*<=0.1250.25-0.5->0.5氟胞嘧啶<=4-8-16>16伏立康唑<=12->=4判斷抗真菌藥的敏感性和耐藥性NCCLS/CLSI紙片擴(kuò)散法測定念珠菌體外敏感試驗(yàn)的臨界濃度判讀抑菌菌直徑（mm）敏感S劑量依賴性敏感SDD耐藥R氟康唑>=1915-18<=14伏立康唑>=1714-16<=13抗真菌藥的療效受多種因素的影響體內(nèi)組織濃度感染部位的病原菌濃度疾病診斷的準(zhǔn)確性疾病的嚴(yán)重性，有無并發(fā)癥機(jī)體的免疫功能不良反應(yīng)的耐受性其它的治療措施抗真菌體外藥敏試驗(yàn)的臨床意義藥敏試驗(yàn)對臨床有一定指導(dǎo)意義抗真菌藥敏試驗(yàn)與抗真菌治療療效的相關(guān)性尚未明確不能單純根據(jù)其MIC值來預(yù)測臨床療效真菌體外藥敏試驗(yàn)方法尚未完全成熟由于疾病和人體的復(fù)雜性，很難確定體外抗菌活性和臨床治療結(jié)果之間的關(guān)系體外抗真菌藥敏試驗(yàn)與體內(nèi)療效“90-60原則”—MIC值與臨床療效藥敏試驗(yàn)敏感菌株：90%對治療有效藥敏試驗(yàn)?zāi)退幘辏?0%對治療有效

臨床抗真菌藥物耐藥現(xiàn)況在臨床上，真菌感染率的上升，提高了對抗真菌藥物的使用率，隨之而來耐藥菌株也不斷增多，給臨床的治療帶來一定的困難；最近科學(xué)家證實(shí)：某些能夠引起致命感染的曲霉菌對目前的抗真菌藥已有耐藥性，而且這種耐藥性正以驚人的速度蔓延?？拐婢幬锏幕瘜W(xué)分類分類代表藥物中文名外文名多烯類兩性霉素BAmB唑類（吡咯類）咪唑類第一代咪康唑Miconazole第二代酮康唑Ketoconazole三唑類第一代伊曲康唑氟康唑IRCFlu第二代伏立康唑普沙康唑拉夫康唑VRCPosaconazoleRavuconazole嘧啶類氟胞嘧啶Flucytosine丙烯胺類特比萘芬Terbinafi