分光光度技術(shù)3-4

第二章

分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)

分光光度技術(shù)(分光光度法)主要是指利用物質(zhì)特有的光譜來鑒定物質(zhì)性質(zhì)及含量的技術(shù)，其理論依據(jù)是Lambert和Beer定律。分光光度法是比色法的發(fā)展:比色法只限于在可見光區(qū)，分光光度法則可以擴(kuò)展到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。比色法用的單色光是來自濾光片，譜帶寬度從40－120nm，精度不高，分光光度法則要求近于真正單色光，其光譜帶寬最大不超過3－5nm，在紫外區(qū)可到1nm以下，來自棱鏡或光柵，具有較高的精度。分光光度技術(shù)基本原理

分光光度計(jì)

基本結(jié)構(gòu)簡介

分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用

分光光度法的誤差

分光光度技術(shù)基本原理一、光的基本知識(shí)

光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續(xù)的微粒性和連續(xù)的波動(dòng)性。波長和頻率是光的波動(dòng)性的特征，可用下式表示：

Ｃ

λ＝───

Ｖ

式中λ為波長，具有相同的振動(dòng)相位的相鄰兩點(diǎn)間的距離叫波長。Ｖ為頻率，即每秒鐘振動(dòng)次數(shù)。Ｃ為光速等于299770千米／秒。光屬于電磁波。自然界中存在各種不同波長的電磁波，分光光度法所使用的光譜范圍在200nm-10μ（1μ=1,000nm）之間。其中200nm－400nm為紫外光區(qū)，400nm－760nm為可見光區(qū)，760nm－10,000nm為紅外光區(qū)。自然界的電磁波譜

自然界的電磁波譜①γ射線(γ-ray)它是放射性物質(zhì)發(fā)出的電磁波,波長在2×10-10m以下。是一種能量很大的光子流。在醫(yī)療上用γ射線作為“手術(shù)刀”來切除腫瘤,叫做γ刀,有很好的治療效果。②X射線(X-ray)它是由X射線管產(chǎn)生的電磁波，波長在10-15~10-7m，X射線對(duì)不同密度的物質(zhì)有不同的穿透力。在醫(yī)學(xué)上常用作醫(yī)療檢查。在飛機(jī)場安全檢查中，也常用X射線對(duì)行李進(jìn)行透視查驗(yàn)。自然界的電磁波譜③紫外線(ultravioletray)當(dāng)光電流通過兩電極間的電離氣體時(shí)，會(huì)產(chǎn)生紫外線。其波長在4×10-8~4×10-7m。太陽光中含有紫外線。紫外線能激發(fā)熒光，日光燈就是管內(nèi)紫外線激發(fā)涂在燈管內(nèi)壁上的熒光粉而發(fā)出的近似日光光譜的照明燈。紫外線也常用在醫(yī)學(xué)上殺菌和防偽技術(shù)上。自然界的電磁波譜④可見光(visiblelight)它是能引起人的視覺感覺的電磁波，其波長范圍是0.4×10-6~0.8×10-6m。太陽能發(fā)出可見光?？梢姽馐怯刹煌壤钠呱?紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫)所混合組成。⑤紅外線(infraredray)通常情況下由灼熱物體發(fā)出的電磁波，其波長范圍是0.8×10-6~1×10-3m。它們會(huì)導(dǎo)致物體溫度的升高。紅外電磁波在特定的紅外敏感膠片上能形成熱成像。自然界的電磁波譜⑥微波(microwave)——常用于雷達(dá)設(shè)備上的波長很短的無線電波，其波長范圍在1×10-3~1m。由于微波的定向性好，常用發(fā)射、反射波的時(shí)間來測算目標(biāo)的位置。微波爐是一種用微波的熱效應(yīng)來烹調(diào)食品的裝置。⑦無線電波(radiowave)它是在電磁場的作用下無線電天線中自由電子發(fā)生振蕩而產(chǎn)生的電磁波。波長范圍在0.75×10-3~1×104m。分光光度技術(shù)基本原理朗伯－比爾（Lambert-Beer）定律

吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比.A＝－lgT＝KLCA——吸光度，又稱光密度“O.D”。T——透光度，T＝I/I。，I。-為照射到吸收池上的光強(qiáng)，I-為透過吸收池的光強(qiáng)。k——摩爾吸光系數(shù)（L·mol－1·cm－1）。L——樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，L=1cm。C-——樣品濃度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“k”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。分光光度技術(shù)基本原理吸光系數(shù)K取決于入射光的波長，溶液的性質(zhì)和溫度等，而與光的強(qiáng)度、溶液的濃度及液層的厚度無關(guān)。在一定波長下，它是物質(zhì)的特性常數(shù)。不同物質(zhì)可能有相同的最大吸收波長，但其吸光系數(shù)不一定相同。K值愈大，說明該物質(zhì)溶液對(duì)光吸收愈強(qiáng)烈，則比色測定的靈敏度愈高。分光光度技術(shù)基本原理吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：A＝k1L1C1＋k2L2C2＋k3L3C3＋……即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)簡介

分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)簡介

能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來并測量其強(qiáng)度的儀器稱為分光光度計(jì)。分光光度計(jì)因使用的波長范圍不同而分為紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬用（全波段）分光光度計(jì)等。無論哪一類分光光度計(jì)都由下列五部分組成，即光源、單色器、狹縫、樣品池，檢測器系統(tǒng)。

基本結(jié)構(gòu)簡介----光源

光源要求能提供所需波長范圍的連續(xù)光譜，穩(wěn)定而有足夠的強(qiáng)度。常用的有白熾燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等多種。鎢燈和鹵鎢燈發(fā)射320－2000nm連續(xù)光譜，最適宜工作范圍為360－1000nm，穩(wěn)定性好，用作可見光分光光度計(jì)的光源。氫燈和氘燈能發(fā)射150－400nm的紫外結(jié)，可用作紫外光區(qū)分光光度計(jì)的光源。汞燈發(fā)射的不是連續(xù)光譜，能量絕大部分集中在253.6nm波長外，一般作波長校正用。鎢燈在出現(xiàn)燈管發(fā)黑時(shí)應(yīng)及更換，如換用的燈型號(hào)不同，還需要調(diào)節(jié)燈座的位置的焦距。氫粘及氘燈的燈管或窗口是石英的，且有固定的發(fā)射方向，安裝時(shí)必須仔細(xì)校正接觸燈管時(shí)應(yīng)戴手套以防留下污跡?；窘Y(jié)構(gòu)簡介

----單色器分光系統(tǒng)（單色器）

單色器是指能從混合光波中分解出來所需單一波長光的裝置，由棱鏡或光柵構(gòu)成。用玻璃制成的棱鏡色散力強(qiáng)，但只能在可見光區(qū)工作，石英棱鏡工作波長范圍為185---4000nm，在紫外區(qū)有較好的分辯力而且也適用于可見光區(qū)和近紅外區(qū)。棱鏡的特點(diǎn)是波長越短，色散程度越好，越向長波一側(cè)越差。所以用棱鏡的分光光度計(jì)，其波長刻度在紫外區(qū)可達(dá)到0.2nm，而在長波段只能達(dá)到5nm。有的分光光系統(tǒng)是衍射光柵，即在石英或玻璃的表面上刻劃許多平行線，刻線處不透光，于是通過光的干涉和衍射現(xiàn)象，較長的光波偏折的角度大，較短的光波偏折的角度小，因而形成光譜。基本結(jié)構(gòu)簡介----狹縫、樣品池狹縫

狹縫是指由一對(duì)隔板在光通路上形成的縫隙，用來調(diào)節(jié)入射單色光的純度和強(qiáng)度，也直接影響分辯力。狹縫可在0－2mm寬度內(nèi)調(diào)節(jié)，由于棱鏡色散力隨波長不同而變化，較先進(jìn)的分光光度計(jì)的狹縫寬度可隨波長一起調(diào)節(jié)。比色杯

比爭杯也叫樣品池，吸收器或比色皿，用來盛溶液，各個(gè)杯子壁厚度等規(guī)格應(yīng)盡可能完全相等，否則將產(chǎn)生測定誤差。玻璃比色杯只適用于可見光區(qū)，在紫外區(qū)測定時(shí)要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光學(xué)面，用后要及時(shí)洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。基本結(jié)構(gòu)簡介----檢測系統(tǒng)

有許多金屬能在光的照射下產(chǎn)生電流，光愈強(qiáng)電流愈大，此即光電效應(yīng)。因光照射而產(chǎn)生的電流叫做光電流。受光器有兩種，一是光電池，二是光電管。光電池的組成種類繁多，最常見的是硒光電池。光電池受光照射產(chǎn)生的電流頗大，可直接用微電流計(jì)量出。但是，當(dāng)連續(xù)照射一段時(shí)間會(huì)產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象而使光電流下降，要在暗中放置一些時(shí)候才能恢復(fù)。因此使用時(shí)不宜長期照射，隨用隨關(guān)，以防止光電池因疲勞而產(chǎn)生誤差。

基本結(jié)構(gòu)簡介----檢測系統(tǒng)光電管裝有一個(gè)陰極和一個(gè)陽極，陰極是用對(duì)光敏感的金屬（多為堿土金屬的氧化物）做成，當(dāng)光射到陰極且達(dá)到一定能量時(shí)，金屬原子中電子發(fā)射出來。光愈強(qiáng)，光波的振幅愈大，電子放出愈多。電子是帶負(fù)電的，被吸引到陽極上而產(chǎn)生電流。光電管產(chǎn)生電流很小，需要放大。分光光度計(jì)中常用電子倍增光電管，在光照射下所產(chǎn)生的電流比其他光電管要大得多，這就提高了測定的靈敏度?；窘Y(jié)構(gòu)簡介----檢測系統(tǒng)檢測器產(chǎn)生的光電流以某種方式轉(zhuǎn)變成模擬的或數(shù)字的結(jié)果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記錄器、示波器及與計(jì)算機(jī)聯(lián)用等，數(shù)字輸出則通過模擬／數(shù)字轉(zhuǎn)換裝置如數(shù)字式電壓表等。721型可見分光光度計(jì)工作波長：340-1000nm721系列可見分光光度計(jì)工作波長：340-1000nm721系列可見分光光度計(jì)（掃描型）配置：簡，操作軟件、定量分析、時(shí)間掃描，可選配打印機(jī)、計(jì)算機(jī)751型紫外可見分光光度計(jì)工作波長：200-1000nm755PC型紫外可見分光光度計(jì)標(biāo)配：操作軟件、定量分析、時(shí)間掃描、光譜掃描，可選配打印機(jī)、計(jì)算機(jī)UNICO-2102紫外可見分光光度計(jì)工作波長：200-1000nm分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用測定溶液中物質(zhì)的含量單一物質(zhì)的定量分析先測出其吸收光譜曲線，找出最大吸收波長。含量測定時(shí)所用波長通常要選擇被測物質(zhì)的最大吸收波長，這樣做有兩個(gè)好處：⑴靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；⑵可以避免其它物質(zhì)的干擾?？梢娀蜃贤夥止夤舛确ǘ伎捎糜跍y定溶液中物質(zhì)的含量。測定標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度已知的溶液）和未知液（濃度待測定的溶液）的吸光度，進(jìn)行比較，由于所用吸收池的厚度是一樣的。也可以先測出不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條直線，然后測定出未知液的吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其相對(duì)應(yīng)的濃度。

分光光度計(jì)的應(yīng)用----定量分析混合樣品的定量分析吸收光譜不重疊的混合物定量方法-----互不干擾分別測定吸收光譜重疊的混合物定量方法采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以克服光譜定量分析中出現(xiàn)的多重共線性、光譜重疊和組分的相互干擾等問題,并且不需分離可直接同時(shí)測定混合體系的各組分。因此發(fā)展了如主成分回歸(PCR)、小波包變換、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)以及遺傳算法等多種線性或非線性的多元校準(zhǔn)方法,波長選擇是光譜分析中各種多元校準(zhǔn)方法的關(guān)鍵步驟。

分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用定性鑒定用紫外光譜鑒定化合物

使用分光光度計(jì)可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對(duì)每一種單色光的吸光度，然后以波長為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)繪制吸光度──波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進(jìn)行物質(zhì)種類的鑒定。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用一定物質(zhì)在不同濃度時(shí)，其吸收光譜曲線中，峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低峰的波長是一定不變的。當(dāng)一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線一樣時(shí)，則很可能它們是同一物質(zhì)。紫外線吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)造成的，含有雙鍵的化合物表現(xiàn)出吸收峰。紫外吸收光譜比較簡單，同一種物質(zhì)的紫外吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。除了特殊情況外，單獨(dú)依靠紫外吸收光譜決定一個(gè)未知物結(jié)構(gòu)，必須與其它方法配合。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用結(jié)構(gòu)分析作為結(jié)構(gòu)分析，紫外吸收光譜遠(yuǎn)不及紅外吸收光譜重要可靠，因?yàn)樽贤馕展庾V曲線的特征性不及紅外光譜曲線，紅外光譜曲線屬‘指紋’型，而大多數(shù)有機(jī)化合物在紫外光區(qū)無吸收。利用紫外吸收光譜可鑒定化合物中具有共軛系統(tǒng)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用在生化分析領(lǐng)域主要用于氨基酸含量的測定、蛋白質(zhì)含量的測定、核酸的測定、酶活力測定、生物大分子的鑒定和酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究等。分光光度計(jì)的誤差濃度過高或過低的樣品，易引起檢測器標(biāo)尺上的讀數(shù)誤差。從理論上推算，相對(duì)誤差最小的部分在透光度為36.8%處（或吸光度為0.4343處），故通常認(rèn)為測定值在吸光度0.20-0.80范圍內(nèi)（透光度為20%—65%）誤差最小，超出此范圍，相對(duì)誤差均會(huì)增大。分光光度計(jì)的誤差影響分光光度計(jì)精確度的主要原因還有光譜純度。一般應(yīng)保持光譜帶寬度在10nm以下，如果測定樣品中有很狹窄的吸收峰，就必須有更小的光譜寬度，所以分光光度計(jì)均有可調(diào)的狹縫。在實(shí)際應(yīng)用中，用較大的狹縫雖然可提高重現(xiàn)性，但加大光譜寬度反而減低了準(zhǔn)確度。原則為：在保證測定的情況下，應(yīng)用較低的狹縫分光光度計(jì)的誤差散射光也是引起誤差的重要因素。散射光指一切未經(jīng)過測定溶液吸收，而又落到檢測器上引起干擾的光，如室內(nèi)自然光，也包括能透過比色皿的非測定需要的其它波長的光。

散射光干擾對(duì)高濃度測定特別有害，能使吸光度降低，標(biāo)準(zhǔn)曲線的高濃部分向下彎曲。

使用原則：分光光度計(jì)宜安裝在光線較暗的室內(nèi)。

熒光分析法光致發(fā)光：物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長的光之外還會(huì)發(fā)射出比原來所吸收的波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。熒光：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。我們通常所說的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒光，以及吸收波長較短的可見光后發(fā)出波長較長的可見熒光。除了紫外熒光和可見熒光，還有紅外熒光、X射線熒光等

熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測定的方法。特點(diǎn)：1）靈敏度高2）選擇性好3）方法簡單快速，用樣量少4）應(yīng)用受限熒光分析法的基本原理一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜二、熒光與分子結(jié)構(gòu)三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級(jí)與激發(fā)過程

基態(tài)+hv→激發(fā)態(tài)光譜中電子能級(jí)可分為二組：1）電子自旋配對(duì)的（電子自旋方向相反，電子的凈自旋S=0，譜線多重性M=2S+1=1）稱為單重態(tài)或單線態(tài)，以S表示。2）電子自旋非配對(duì)的（電子自旋方向相同，其凈自旋S=1，譜線多重性M=3）稱為三重態(tài)或三線態(tài)，以T表示。

激發(fā)單重態(tài)與相應(yīng)的三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同及三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。三重態(tài)壽命較長。2、熒光的產(chǎn)生基態(tài)光輻射激發(fā)態(tài)基態(tài)釋放能量振動(dòng)弛豫（vibrational

relexation）處于激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子通過與溶劑分子的碰撞，能量傳遞給溶劑分子，電子返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

特點(diǎn)：無輻射躍遷；只能在同一電子能級(jí)內(nèi)進(jìn)行；時(shí)間約為10-12s；使大多數(shù)電子激發(fā)態(tài)處于其最低振動(dòng)能級(jí)上。內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（internalconversion）：內(nèi)轉(zhuǎn)換兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級(jí)以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的過程。

特點(diǎn)：無輻射躍遷；兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)具有相同的多重性（都是單重態(tài)或都是三重態(tài)，如S2*→S1*，T2*→T1*）。處于激發(fā)單重態(tài)的分子通過振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換，均可返回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

熒光發(fā)射處于第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)上，發(fā)射的光量子稱為熒光。

特點(diǎn)：

1）發(fā)射光量子，且熒光波長總是長于激發(fā)光波長；

2）時(shí)間約為10-9-10-7s；

3）熒光譜線有時(shí)呈現(xiàn)幾個(gè)非常接近的峰（電子返回到基態(tài)不能振動(dòng)能級(jí)，能級(jí)差不同，吸收波長不同）；

4）處于基態(tài)不同能級(jí)的電子會(huì)通過振動(dòng)弛豫返回到基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)。（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜（excitationspectrum）：不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對(duì)效率。繪制：固定發(fā)射波長，熒光強(qiáng)度（F）對(duì)激發(fā)波長（λex）的關(guān)系曲線，其形狀與吸收光譜相似。熒光光譜（fluorescencespectrum）：在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對(duì)強(qiáng)度。繪制：固定激發(fā)光波長和強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度（F）對(duì)發(fā)射波長（λem）的關(guān)系曲線。熒光分析法通常采用λexmax與λemmax。（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)同時(shí)具備兩個(gè)條件：

1）有強(qiáng)的紫外-可見吸收

2）有一定的熒光效率

長共軛分子→較強(qiáng)紫外吸收

剛性平面結(jié)構(gòu)分子→較高熒光效率{1、長共軛結(jié)構(gòu)具有π→π*躍遷大多數(shù)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，π電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度越大，熒光波長也長移。2、分子的剛性-共平面性分子剛性-共平面性越強(qiáng)，熒光效率越大，熒光波長越長。3、取代基

1）給電子取代基，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等，能增加分子的π電子共軛程度，常使熒光效率提高，熒光波長長移。

2）吸電子取代基，如-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等，減弱分子的π電子共軛程度，使熒光減弱甚至熄滅。

3）取代基對(duì)π電子共軛體系作用較小，如-R、-SO3H、-NH3+等，對(duì)熒光影響也不明顯。熒光探針分子的幾個(gè)基本要求

（1）能產(chǎn)生穩(wěn)定的，較強(qiáng)的熒光。（2）探針與被研究分子的某一微區(qū)必須有特異性的結(jié)合，而且結(jié)合得比較牢固。（3）探針的熒光必須對(duì)環(huán)境條件較敏感。（4）結(jié)合的探針不應(yīng)影響被研究的大分子的結(jié)構(gòu)和特性。（三）熒光試劑弱/無熒光物質(zhì)+熒光試劑→強(qiáng)熒光產(chǎn)物1、熒光胺（fluorescamine）：特點(diǎn)：與脂肪族和芳香族伯胺形成高度熒光衍生物。熒光胺及其水解產(chǎn)物均不顯熒光。熒光條件：λex=275/390nm，λem=480nm。

2、鄰苯二甲醛（OPA）：特點(diǎn)：在2-巰基乙醇存在下，pH9-10的緩沖溶液中能與伯胺類、特別是半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的α-氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。熒光條件：λex=340nm，λem=455nm。例：測定磺胺類藥物3、1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（Dansyl-Cl，DANS-Cl，丹酰氯）：

與伯、仲胺及酚基的生物堿反應(yīng)生成熒光物質(zhì)。丹酰肼（Dansyl-NHNH2）：與可的松等的羰基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件：λex=365nm，λem=500nm?！坊幬锏臏y定雌激素的測定→4、測定無機(jī)離子的熒光試劑無機(jī)離子+有機(jī)化合物→配合物→直接測定熒光強(qiáng)度加入無機(jī)離子（如CN-、F-等）配合物熒光減弱或消失熒光猝滅法三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素1、溫度：溫度↑→熒光效率↓，熒光強(qiáng)度↓原因：溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加，從而降低了熒光效率。2、溶劑：

1）溶劑極性：極性↑→熒光波長↑，熒光強(qiáng)度↑原因：極性溶劑中，π→π*躍遷能量差ΔE小，使紫外吸收波長和熒光波長均長移；躍遷幾率增加，使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

2）溶劑粘度：粘度↓→熒光強(qiáng)度↓原因：溶劑粘度低，分子間碰撞機(jī)會(huì)增加，使無輻射躍遷增加，使熒光減弱。溫度↑→溶劑粘度↓→熒光強(qiáng)度↓3、酸度：熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的酸度對(duì)其熒光強(qiáng)度有較大影響，因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡改變，因此熒光強(qiáng)度也有差異。如苯胺：在pH7-12溶液中主要以分子形式存在，發(fā)生藍(lán)色熒光；pH<2或pH>13的溶液中均以離子形式存在，不發(fā)射熒光。

4、熒光熄滅劑：熒光熄滅：熒光猝滅，指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。作用機(jī)制：

1）熒光物質(zhì)分子和熄滅劑分子碰撞而損失能量；

2）熒光物質(zhì)分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配位化合物；

3）溶解氧的存在，使熒光物質(zhì)氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進(jìn)體系間跨越，激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)；

4）濃度較大（超過1g/L）時(shí)，發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。熒光熄滅法（fluorescencequenchingmethod）：熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強(qiáng)度的減弱和熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，利用這一性質(zhì)測定熒光熄滅劑的含量的方法。熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系溶液的熒光強(qiáng)度在樣品濃度較低時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。但到了一定濃度以后，就不再存在這種正比關(guān)系。在較濃的溶液中，熒光強(qiáng)度并不隨溶液濃度呈正比增長。因此，必須找出與熒光強(qiáng)度呈線性的濃度范圍。

熒光物質(zhì)濃度過大時(shí)，常常發(fā)生猝滅現(xiàn)象。這樣就使熒光強(qiáng)度反而大大低于接近飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度。對(duì)濃度猝滅產(chǎn)生的原因，最簡單的解釋是：激發(fā)態(tài)分子在發(fā)出熒光之前就和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而自猝滅。濃度過高，還可能形成樣品分子的二聚體或多聚體，因而降低熒光強(qiáng)度。

條件：極稀溶液

二、定量分析方法1、校正曲線法：以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)。2、比例法：在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣熒光強(qiáng)度，對(duì)比。3、聯(lián)立方程式法：用于多組分混合物的熒光分析。

熒光分光光度計(jì)

和熒光分析新技術(shù)一、熒光分光光度計(jì)濾光片熒光計(jì)：激發(fā)濾光片讓激發(fā)光通過；發(fā)射濾光片常用截止濾光片，截去所有的激發(fā)光和散射光，只允許試樣的熒光通過，不能測定光譜，只用于定量分析。濾光片-單色器熒光計(jì)：將發(fā)射濾光片用光柵代替，不能測定激發(fā)光譜，可測定熒光光譜。熒光分光光度計(jì)：兩個(gè)濾光片都用光柵取代，可繪制激發(fā)光譜和熒光光譜。1、熒光分光光度計(jì)的主要部件：激發(fā)光源：氙燈、高壓汞燈、激光激發(fā)單色器（樣品池前）：光柵或?yàn)V光片發(fā)射單色器（樣品池后）：光柵或?yàn)V光片樣品池：石英檢測系統(tǒng)：光電倍增管2、儀器的校正（1）靈敏度校正：用被檢測出的最低信號(hào)來表示，或用某一對(duì)照品的稀溶液在一定激發(fā)波長光的照射下，能發(fā)射出最低信噪比時(shí)的熒光強(qiáng)度的最低濃度表示。（2）波長校正：用汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器波長刻度校正。（3）激發(fā)光譜和熒光光譜的校正二、熒光分析新技術(shù)簡介1、激光熒光分析光源：激光，單色性極好，強(qiáng)度更大。優(yōu)點(diǎn)：提高了熒光分析法的靈敏度和選擇性。2、時(shí)間分辨熒光分析：利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測之間延緩的時(shí)間不同，以實(shí)現(xiàn)分別檢測的目的。光源：脈沖激光。應(yīng)用：多用于臨床檢驗(yàn)，如乙肝病毒的檢測，甲狀腺功能檢測等。測定水中痕量釷的熒光時(shí)間分辨圖利用時(shí)間分辨熒光法消除鋁、鋯等的干擾從圖中可見，在12s內(nèi)測定熒光信號(hào)，可基本消除鋁、鋯的影響。

3、同步熒光分析（synchronousfluorometry）

原理：在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇一適宜的波長差值Δλ（通常選用λexmax與λemmax之差），同時(shí)掃描發(fā)射波長和激發(fā)波長，得到同步熒光光譜。若Δλ值相當(dāng)于或大于斯托克斯位移，就能獲得尖而窄的同步熒光峰。熒光物質(zhì)濃度與同步熒光峰峰高呈線性關(guān)系，可用于定量分析。

優(yōu)點(diǎn)：譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。

同步光譜4、膠束增敏熒光分析

膠束溶液即濃度在臨界濃度以上的表面活性劑溶液，極性溶劑中，形成親水基向外、疏水基向內(nèi)的膠束。優(yōu)點(diǎn)：

1）極性較小而難溶于水的熒光物質(zhì)在膠束溶液中溶解顯著增加；

2）膠束溶液對(duì)熒光物質(zhì)有增敏和增穩(wěn)作用。熒光分析在生物學(xué)中的應(yīng)用

（一）天然熒光物質(zhì)的應(yīng)用生物學(xué)中比較重要的天然熒光分子多屬具有共軛雙鍵的系統(tǒng)。如芳香氨基酸、核黃素、維生素A、卟啉、葉綠素、NADH和tRNA中的Y堿基（二氫尿嘧啶）等。對(duì)于含有這些天然熒光物質(zhì)的樣品，可以直接通達(dá)量測其熒光來確定其存在，分布及數(shù)量。1.蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光利用蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光檢測蛋白，其靈敏度高于紫外吸收法。蛋白質(zhì)的熒光來自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，它們的相對(duì)熒光強(qiáng)度為100:9:0.5。檢測蛋白質(zhì)的天然熒光，可采用280nm的激發(fā)波長，發(fā)射波長范圍在300-350（蛋白溶液為中性時(shí)）。如果蛋白中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪氨酸(稱為A類蛋白質(zhì))，則熒光光譜主要表現(xiàn)酪氨酸的特征，最大發(fā)射波長約為304nm。對(duì)于含有色氨酸的蛋白(稱為B類蛋白質(zhì))，熒光光譜則主要表現(xiàn)色氨酸的特征，最大熒