蛋白質(zhì)多重標(biāo)記

閱讀研討

分析化學(xué)專業(yè)：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)閱讀文獻(xiàn)

MultipleLabelingofProteinsDesignof3-(4-Carboxybenzoyl)-2-quinolinecarboxaldehydeasaReagentforUltrasensitiveDeterminationofPrimaryAminesbyCapillaryElectrophoresisUsingLaserFluorescenceDetectionKineticsandapparentactivationenergyofthereactionofthefluorogenicreagent5-furoylquinoline-3-carboxaldehydewithovalbumin目錄contents1234論文主題研究?jī)?nèi)容如何支持主題層次和邏輯研究方法

5分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)6存在不足論文主題TOPICNO.1論文主題毛細(xì)電泳法測(cè)定的蛋白質(zhì)往往都需要熒光標(biāo)記,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多重標(biāo)記的熒光蛋白電泳譜帶較天然蛋白的電泳譜帶而言明顯變寬。NO.1論文主題本文通過(guò)觀察比較區(qū)帶電泳法測(cè)得天然綠色熒光蛋白和FQ標(biāo)記的綠色熒光蛋白的譜帶，證明多重?zé)晒鈽?biāo)記導(dǎo)致譜帶變寬并分析其原因。研究?jī)?nèi)容支持主題

NO.2研究?jī)?nèi)容如何支持主題?文中提出大多數(shù)標(biāo)記蛋白無(wú)法區(qū)分結(jié)合在賴氨酸殘基上N末端的胺和組胺，實(shí)驗(yàn)通過(guò)跟蹤綠色熒光蛋白和FQ的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在10min反應(yīng)下，標(biāo)記分子和有多個(gè)標(biāo)記物附著，即多重標(biāo)記，導(dǎo)致譜帶展寬。層次邏輯

NO.3層次&邏輯開頭--摘要：介紹了文章的基本內(nèi)容介紹了實(shí)驗(yàn)研究的背景知識(shí)（如毛細(xì)管電泳，熒光標(biāo)記以及它們可能出現(xiàn)的誤差）引出論文的關(guān)鍵詞和大概內(nèi)容敘述實(shí)驗(yàn)的過(guò)程與數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和討論例舉本文得到的肯定，增強(qiáng)文章的說(shuō)服力NO.3層次&邏輯

文章脈絡(luò)清晰，邏輯清楚。

研究方法④NO.4研究方法

熒光標(biāo)記通常用于提高毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)分析的靈敏度。然而，與天然蛋白質(zhì)的吸收檢測(cè)法比較，柱前標(biāo)簽經(jīng)常導(dǎo)致不良的電泳分辨率。普遍認(rèn)為，這一峰展寬來(lái)自多個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)記。大多數(shù)標(biāo)簽反應(yīng)依賴于攻擊伯胺的試劑。這些試劑不能有效區(qū)分結(jié)合在賴氨酸殘基上的N末端胺和其他區(qū)胺。標(biāo)簽通常可能會(huì)去完成一個(gè)產(chǎn)生復(fù)雜混合物的標(biāo)記反應(yīng)，使得蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，然后異構(gòu)反應(yīng)產(chǎn)物有不同的遷移率，在電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)能帶增寬。NO.4研究方法

為證明文章所述，通過(guò)控制變量來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。NO.4研究方法

1、用5mM硼酸鹽和3.7*10-5M溶解的GFP、1.5mm氰化鈉加入100nmol干FQ配成10微升，分別進(jìn)行三組然后室溫孵化1、5、10分鐘。2、立即稀釋4個(gè)數(shù)量級(jí)，以熄滅這個(gè)反應(yīng)。3、在加上無(wú)處理GFP共四種溶液通過(guò)氬離子激光然后通過(guò)帶有硼酸緩沖液未涂覆的毛細(xì)管的毛細(xì)管帶電泳分析。4、進(jìn)行分析圖譜證明本文觀點(diǎn)

分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)⑤NO.5分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用FQ標(biāo)記的蛋白，通過(guò)不同反應(yīng)時(shí)間（分別為1min，5min，10min）的光譜圖可知，1min時(shí)，分出五個(gè)峰，其他時(shí)間峰聚集在一起，沒(méi)有分析意義。在一分鐘的光譜圖中，還檢測(cè)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)物流動(dòng)性與標(biāo)記物數(shù)量呈線性負(fù)相關(guān)。NO.5分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)綜上，得到兩點(diǎn)結(jié)論:一、物質(zhì)敷浴的時(shí)間是導(dǎo)致峰變寬的一個(gè)因素，此次實(shí)驗(yàn)中一分鐘時(shí)最佳敷浴時(shí)間。二、標(biāo)記物的數(shù)量會(huì)影響蛋白質(zhì)數(shù)量的檢測(cè)，是導(dǎo)致峰帶變寬又一因素

存在不足⑥NO.6存在不足1、沒(méi)有給出有效解決熒光標(biāo)記蛋白的多重附著導(dǎo)致峰展寬的辦法。2、用了單一的FQ染色而沒(méi)有對(duì)其他標(biāo)記物進(jìn)行考慮和探究。

基本原理

遷移時(shí)間：HPCE具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性有關(guān)色譜理論均適用V：外加電壓；L：毛細(xì)管總長(zhǎng)度；μapp：表觀淌度；

Ld：毛細(xì)管有效長(zhǎng)度；分離效率（理論塔板數(shù)N）在空心HPCE中，僅存在縱向擴(kuò)散評(píng)價(jià)峰展寬（柱效）衡量CE系統(tǒng)性能N與E成正比，E越大，柱效越高由于溶質(zhì)在較高的電壓下，以較快的速度通過(guò)柱子，縱向擴(kuò)散?。ò偃f(wàn)）M↑，D↓，N↑HPCE適合于分離分析生物大分子（擴(kuò)散系數(shù)小）電泳淌度μep（electrophoreticmobility，遷移率）：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)下離子的電泳速度表述物質(zhì)電泳特性的參數(shù)，與粒子電荷、大小、介質(zhì)粘度等有關(guān)分離度影響分離度的主要因素；工作電壓；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度與總長(zhǎng)度比Ld/L；表觀淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：

反應(yīng)條件

FQ:FQ用來(lái)做什么？檢測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)大多需要衍生FQ是一種用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)文獻(xiàn)針對(duì)FQ對(duì)熒光蛋白（GFP）的標(biāo)記進(jìn)行研究FQ如何標(biāo)記GFP？＋FQ與氨基酸的反應(yīng)實(shí)際是與伯胺的反應(yīng)一個(gè)蛋白質(zhì)分子中存在伯胺基團(tuán)有哪些？蛋白質(zhì)中除N端伯胺外還存在大量賴氨酸殘基

從而使標(biāo)記反應(yīng)可能發(fā)生賴氨酸的ε-氨基一個(gè)N端的伯胺+20個(gè)賴氨酸殘基對(duì)于GFP來(lái)說(shuō)238個(gè)氨基酸FQ如何標(biāo)記GFP？如果標(biāo)記GFP中所有的伯胺基團(tuán)？理論上可行而且如果能同時(shí)快速標(biāo)記所有就不會(huì)存在展寬嚴(yán)重問(wèn)題但實(shí)際這實(shí)際非常復(fù)雜在賴氨酸上百個(gè)的蛋白質(zhì)中這種方法難度太大無(wú)法做到只標(biāo)記一個(gè)或幾個(gè)伯胺基團(tuán)？產(chǎn)物會(huì)非常多N個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生2n-1種標(biāo)記產(chǎn)物在電泳時(shí)自然泳動(dòng)速度有差異譜帶展寬非常嚴(yán)重不確定性！?。Q+蛋白質(zhì)→FQ蛋白質(zhì)復(fù)合物FQ蛋白質(zhì)復(fù)合物+FQ→2FQ蛋白