谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定

谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握谷轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的原理和方法2.了解轉(zhuǎn)氨酶在生物體內(nèi)的重要作用實(shí)驗(yàn)原理1.轉(zhuǎn)氨酶能催化α-氨基酸的α-氨基與α-酮酸的α-酮基進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化，生成新的氨基酸和新的酮酸，這一過(guò)程稱為轉(zhuǎn)氨基作用。2.動(dòng)物體內(nèi)含量最多的是谷草轉(zhuǎn)氨酶GOT和谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT。GPT在肝臟內(nèi)含量豐富，血清內(nèi)含量極少，但當(dāng)肝臟受損時(shí)，酶從肝細(xì)胞釋放，血清內(nèi)GPT含量升高。GPT能催化的反應(yīng)如右:丙氨酸+酮戊二酸→谷氨酸+丙酮酸3.丙酮酸可與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)，生成丙酮酸二硝基苯腙，該物質(zhì)在堿性溶液中顯棕紅色，利用分光光度計(jì)測(cè)定該棕紅色物質(zhì)的吸光度值，間接測(cè)定丙酮酸的含量，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑與器材分光光度計(jì)水浴鍋血清NaoH溶液1.試劑0.1mol∕L磷酸鹽溶液GPT基質(zhì)液2,4-二硝基苯肼溶液2μmol/ml的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液75%的乙醇2.器材燒杯移液管膠頭滴管容量瓶玻璃棒比色杯電子天平試管及試管架洗耳球等操作步驟一.血清的提取1.電子天平稱量小鼠體重，用75%的乙醇按一定比例對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃。灌胃時(shí)要緊貼上頜，將針頭輕輕旋入胃中，一邊觀察小鼠精神狀態(tài)一邊緩緩注入一定體積的乙醇。2.24h后，摘除小鼠眼睛，于眼部取血至離心管。3.3500r∕min離心5分鐘，用移液槍移去上清液到另一離心管，離心2次。操作步驟二.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1.取6支試管，標(biāo)記后按表1加入溶液ml試劑管號(hào)123456磷酸鹽緩沖液0.100.100.100.100.100.10GPT基質(zhì)液0.500.450.400.350.300.25丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液00.050.100.150.200.25操作步驟2.混勻后，置37度水浴預(yù)溫5min，分別加入2,4-二硝基苯肼溶液0.5mol，混勻，保溫20min,各加0.4mol∕mL的NaoH溶液5ml，混勻，室溫放置10min。3.在520nm波長(zhǎng)下，以1號(hào)管調(diào)零，用分光光度計(jì)測(cè)各管吸光度值。4.以丙酮酸的含量(微摩爾)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作步驟三.GPT活力的測(cè)定1.取3支試管，標(biāo)記后按表2加入溶液ml試劑空白管對(duì)照管樣品管磷酸鹽緩沖液0.02GPT基質(zhì)液0.10.1（37度保溫30min)0.1血清0.022,4-二硝基苯肼0.10.10.1血清0.02（混勻后37度保溫20min）0.1mol∕mLNaoH111操作步驟混勻各管，室溫放置10min。分光光度計(jì)在520nm下，空白管調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。2.用樣品管的吸光值減去對(duì)照管的吸光值，得出吸光值之差。借助標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出該差值對(duì)應(yīng)的丙酮酸微摩爾數(shù)。3.血清GPT活力計(jì)算。轉(zhuǎn)氨酶活力單位可表示為：每100ml血清中GPT的活力單位數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄-表3試管號(hào)123456丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（2μmol/ml）00.05ml0.10ml0.15ml0.20ml0.25ml吸光值00.0690.1770.2000.2820.355實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)-表4空白管對(duì)照管樣品管吸光值0.3290.0050.278實(shí)驗(yàn)結(jié)果吸光值之差=0.278-0.005=0.273代入標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)計(jì)算的丙酮酸濃度為0.64μmol/ml→0.02ml