阿司匹林抗氧化機(jī)制探討

阿司匹林抗氧化作用

機(jī)制的探討主要內(nèi)容研究背景實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖饔脵C(jī)制實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)分組、實(shí)驗(yàn)操作、檢測(cè)指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析預(yù)期結(jié)果可行性分析研究背景阿司匹林是臨床常用的抗炎`抗血栓藥物,其作用主要是通過抑制前列腺素的合成及環(huán)氧化酶的激活而實(shí)現(xiàn)的.最新的研究顯示阿司匹林還具有對(duì)抗過氧化物的損傷`保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的功能,其作用可能與誘導(dǎo)某種保護(hù)性基因表達(dá),抑制活性氧的反應(yīng),特別是阻止鐵介導(dǎo)的氧自由基形成有關(guān).而近期發(fā)現(xiàn)鐵蛋白可以快速結(jié)合細(xì)胞內(nèi)游離鐵,阻止其通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基對(duì)細(xì)胞的氧化損傷.因此,本研究欲證實(shí)阿司匹林的抗氧化作用是通過影響內(nèi)皮細(xì)胞鐵代謝`增加鐵蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的.阿司匹林的抗氧化作用機(jī)制鐵蛋白：鐵蛋白是一種貯存鐵元素的可溶性蛋白質(zhì)，鐵蛋白占體內(nèi)儲(chǔ)存鐵的三分之一，是檢測(cè)人體體內(nèi)是否缺鐵最靈敏的一項(xiàng)指標(biāo)。也是檢測(cè)肝臟是否存在疾患的重要指標(biāo)之一，也是常見的乙肝（乙型病毒性肝炎）檢查項(xiàng)目之一鐵蛋白是鐵的貯存蛋白，體內(nèi)游離的二價(jià)鐵可通過Fenton反應(yīng)催化產(chǎn)生OH造成細(xì)胞的氧化損傷。由于鐵在生物體內(nèi)的含量較其他金屬元素的總和還多得多，因此。它被看作是這類反應(yīng)的主要催化因子。而鐵蛋白與鐵有很高的結(jié)合力，lmol的鐵蛋白可結(jié)合4500mol的鐵，貯存在鐵蛋白中的鐵是三價(jià)形式，已喪失催化活性。因此，鐵蛋白被看作是鐵的生理性螫合劑，具有封閉隔離游離鐵與活性氧分子的反應(yīng)，是過氧化反應(yīng)的抑制劑-。而發(fā)現(xiàn)阿司匹林具有誘導(dǎo)鐵蛋白表達(dá)的作用，對(duì)于解釋其在各種炎癥及心血管疾病中良好的預(yù)防和治療效果將有重要得意義。阿司匹林的抗氧化作用機(jī)制Fenton反應(yīng)過氧化氫與催化劑Fe2+構(gòu)成的氧化體系通常稱為Fenton試劑。在催化劑作用下，過氧化氫能產(chǎn)生兩種活潑的氫氧自由基，從而引發(fā)和傳播自由基鏈反應(yīng)，加快有機(jī)物和還原性物質(zhì)的氧化。Fenton試劑一般在pH3.5下進(jìn)行，在該pH值時(shí)羥基自由基生成速率最大。氧自由基的作用：氧自由基的過氧化殺傷，主要是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，破壞線粒體，斷絕細(xì)胞的能源，毀壞溶酶體，使細(xì)胞自溶。同時(shí)它對(duì)人體的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有危害作用，可以使血管壁上的粘合劑遭受破壞，使完整密封的血管變得千瘡百孔，發(fā)生漏血、滲液，進(jìn)而導(dǎo)致水腫和紫癜等等。說明阿司匹林是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝增加可用于清除鐵的蛋白apo-ferritin(膜脫鐵鐵蛋白)的合成這類鐵蛋白由于處于未飽和狀態(tài)與Fe3+有極高的親和性抑制了Fenton反應(yīng)能有效地阻斷氧自由基的產(chǎn)生而達(dá)到抗H2O2損傷的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶骄堪⑺酒チ挚寡趸饔玫臋C(jī)制；學(xué)習(xí)內(nèi)皮細(xì)胞的原代與傳代培養(yǎng)的方法；觀察不同濃度的阿司匹林在抗H2O2

損傷內(nèi)皮細(xì)胞過程中誘導(dǎo)鐵蛋白(Fn)表達(dá)的情況；培養(yǎng)我們的科研探討的思維、團(tuán)結(jié)協(xié)作和互相交流的能力。實(shí)驗(yàn)材料I型膠原酶、TritOnX-100、Ferritin、Apo-ferritin、阿司匹林、消炎痛、水楊酸鈉均為Sigma公司產(chǎn)品；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、Ⅳ型膠原包被的6孔培養(yǎng)板為Roche公司產(chǎn)品；細(xì)胞因子及內(nèi)毒素(LPS)為北京邦定公司產(chǎn)品;M199培養(yǎng)液(GIBC0BRL公司)；小牛血清、胰蛋白酶、30%H2O2、兔抗人Ⅷ因子血清等為國(guó)產(chǎn)制品。實(shí)驗(yàn)方法人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定,使用膠原包被的6孔培養(yǎng)板并加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(10ng/ml)進(jìn)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿2/3板底并融合成單層時(shí)進(jìn)行傳代,接種于22mm×11mm蓋玻片上。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞呈鋪路石樣鑲嵌單層排列,鑒定使用辣根過氧化物酶法(PAP法)檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原。實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組使用傳2~3代的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

實(shí)驗(yàn)操作在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中加入0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林,孵育24小時(shí)后收獲細(xì)胞測(cè)鐵蛋白含量；僅用1mmol/L的阿司匹林處理細(xì)胞,分別在4、8、16和24小時(shí)收獲細(xì)胞測(cè)定鐵蛋白含量；用0.1mmol/L的去鐵胺及50umol/L的FeCl3預(yù)先孵育細(xì)胞6小時(shí)后加入1mmol/L的阿司匹林,24小時(shí)后收獲細(xì)胞測(cè)鐵蛋白含量。實(shí)驗(yàn)操作以上各對(duì)照組加入等體積的M199液培養(yǎng)相同時(shí)間后收獲細(xì)胞測(cè)鐵蛋白。最后將濃度分別為0.1mmol/L、1.0mmol/L、3.0mmol/L的阿司匹林及1.0mg/ml的Ferritin(已飽和鐵)、1.0mg/ml的apo-ferritin(去鐵蛋白)加入細(xì)胞中預(yù)先孵育8小時(shí)后,再加入濃度為0.5mmol/L的H2O2,對(duì)照組僅加入0.5mmol/L的H2O2,孵育24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),測(cè)上清夜中MDA含量及細(xì)胞LDH釋放率。檢測(cè)指標(biāo)細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白濃度(OD)細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率培養(yǎng)液中丙二醛(MDA)細(xì)胞存活率細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白濃度使用鐵蛋白ELISA試劑盒,取胞漿蛋白質(zhì)懸液50ul,按說明書進(jìn)行操作,并在450nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀上讀取OD值。以各標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為縱軸,鐵蛋白濃度為橫軸,繪制鐵蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。培養(yǎng)液中細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率

LDH采用常規(guī)生化法,分別將測(cè)得的培養(yǎng)液中LDH及細(xì)胞裂解懸液中LDH值通過下列公式計(jì)算LDH釋放率,以校正因?yàn)楦鹘M細(xì)胞數(shù)的差異而對(duì)培養(yǎng)液中LDH值的影響。公式如下:

培養(yǎng)液中MDA采用常規(guī)生化法,按試劑盒(晶美公司)說明書操作細(xì)胞存活率

0.5%臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞,死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色,而活細(xì)胞拒染,分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)目,根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測(cè)定結(jié)果以表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析,兩兩比較用q檢驗(yàn).

預(yù)期結(jié)果不同劑量的阿司匹林誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鐵蛋白的表達(dá)：鐵蛋白表達(dá)的量與阿司匹林濃度之間顯示出劑量依賴的關(guān)系。不同處理時(shí)間阿司匹林誘導(dǎo)鐵蛋白的表達(dá)：鐵蛋白的表達(dá)隨AS處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,兩者間有時(shí)間依賴關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)鐵對(duì)阿司匹林誘導(dǎo)鐵蛋白表達(dá)的影響：去鐵胺(DFO)能消除AS誘導(dǎo)鐵蛋白增加的作用,鐵蛋白濃度下降，比單用AS(1.0mmol/L)組鐵蛋白濃度低；加入FeCl3后鐵蛋白增加，具有明顯促進(jìn)AS誘導(dǎo)鐵蛋白增加的作用。預(yù)期結(jié)果阿司匹林誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞抗H2O2

氧化損傷的作用：正常細(xì)胞加入0.5mmol/L的H2O2孵育24小時(shí)后細(xì)胞絕大部分死亡,LDH釋放率及MDA明顯增高；但加入0.1mmol/L的AS能抵抗H2O2的損傷作用,細(xì)胞存活率及LDH釋放率及MDA與損傷組比較有顯著性差異，且隨AS劑量的增大,抗H2O2損傷的作用增強(qiáng)。Ferritin(已飽和鐵)組對(duì)細(xì)胞無保護(hù)作用,而未含鐵的apo-ferriein則對(duì)細(xì)胞有明顯保護(hù)作用,其結(jié)果類似0.1mmol/L的阿司匹林?？尚行苑治霾牧系目尚行员緦?shí)驗(yàn)使用的藥品,培養(yǎng)基質(zhì)均為實(shí)驗(yàn)常用品,容易獲得方法的可行性1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:Jaffe內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法及辣根過氧化物酶法(PAP法)鑒定均是實(shí)驗(yàn)室常用方法,操作已很成熟.2.實(shí)驗(yàn)分組