淋巴細(xì)胞分離、E花環(huán)

淋巴細(xì)胞分離、E花環(huán)微生物免疫教研室實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰芏忍荻入x心法分離外周血淋巴細(xì)胞的的原理和方法。掌握E花環(huán)測定原理和判定標(biāo)準(zhǔn)熟悉E花環(huán)測定操作方法實(shí)驗(yàn)原理外周血淋巴細(xì)胞分離常用方法是聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法。PBMC與血液中的其他成分存在密度差異，利用密度在1.077±0.002之間，而且近于等滲的Ficoll-Hypaque混合溶液（稱為淋巴細(xì)胞分層液）作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集。血漿和血小板由于密度較低，故懸浮于分層液的上部；紅細(xì)胞與粒細(xì)胞由于密度較大，故沉于分層液的底部；PBMC密度稍低于分層液，故位于分層液界面上，這樣就可獲得淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)材料與試劑①肝素（100U/毫升）、D-Hanks液、淋巴細(xì)胞分離液（ficoll）、瑞氏染液②離心機(jī)、顯微鏡、試管，吸管等。實(shí)驗(yàn)方法與步驟1、采集兔靜脈血，注入盛有肝素（20U/ml）的搪瓷缸中，立即輕輕搖勻，使血液抗凝。2、每組用吸管吸取2ml抗凝血，加入等體積即2ml的室溫D-Hanks液，使血液等倍稀釋。3、每組取已加入2ml淋巴細(xì)胞分離液的試管1支，將離心管傾斜45角，在距分層液界面上1cm處將稀釋血液沿試管壁緩慢加至分層液上面，每管4ml，注意保持兩者界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。4、2500轉(zhuǎn)/分離心20min，離心后，管內(nèi)可分為四層：上層為血漿、血液稀釋液及絕大部分血小板；下層為紅細(xì)胞及粒細(xì)胞；中層為細(xì)胞分層液；分層液與血漿交界部位混濁的灰白色層即為淋巴細(xì)胞層。5、另取1只10ml試管，加入6mlD-Hanks液，用毛細(xì)吸管輕輕插到白膜層，取吸淋巴細(xì)胞層至此試管中，1500轉(zhuǎn)/分離心10min洗滌，共2次。6、棄上清，用1mlD-Hanks定容細(xì)胞，混勻。7、用瑞氏染液染色，觀察所分離細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，并畫圖。瑞氏染色吸取淋巴細(xì)胞涂片，待涂片干燥后，滴加瑞氏染料3-5d，鋪滿玻片，0.5-1min后滴加等量的瑞氏染料緩沖液，用洗耳球吹勻，使染料混合均勻，5-10min后用流水沖洗，待干后鏡檢。注意事項(xiàng)1、將稀釋血液加入Ficoll上時動作要輕，使界面清楚，避免與Ficoll混合。2、操作應(yīng)輕柔，細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻，避免損傷細(xì)胞活性及細(xì)胞丟失。3、細(xì)胞分層液的密度是影響分離效果的關(guān)鍵之一，最適密度在室溫下應(yīng)為1.077±0.002；應(yīng)避光4℃下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用；使用中應(yīng)避免細(xì)菌污染。4、離心時的溫度對分離效果亦有影響，溫度過低，離心時間需適當(dāng)延長，淋巴細(xì)胞丟失增多；溫度過高，增加紅細(xì)胞凝聚，且影響淋巴細(xì)胞活性。離心時最適溫度為18-25℃。E花環(huán)實(shí)驗(yàn)（示教）實(shí)驗(yàn)原理正常人的T淋巴細(xì)胞表面具有能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）表面糖肽相結(jié)合的受體（E受體），即CD2分子，是一種糖蛋白，是T細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志，在體外一定條件下T細(xì)胞能直接與SRBC結(jié)合，形成玫瑰花樣細(xì)胞團(tuán)，稱為E花環(huán)。此實(shí)驗(yàn)即為E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)，常用于檢測T細(xì)胞的數(shù)量、活性及分離T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)材料器材：離心機(jī)、顯微鏡、試管、玻片、毛細(xì)吸管、試劑：詳見實(shí)驗(yàn)教材P248實(shí)驗(yàn)方法1、分離得到淋巴細(xì)胞，計數(shù)后，用Hanks液配成1×107/ml細(xì)胞懸液。2、取0.1ml淋巴細(xì)胞懸液，加入0.1ml1%SRBC及20μl滅活小牛血清，混勻37℃靜置5min，以低速500rpm離心5min，然后放入4℃冰箱2h或過夜。3、取出試管，在細(xì)胞懸浮前，吸棄一半上清液，加入0.8%戊二醛溶液0.1ml，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，置于4℃冰箱固定15min，制成濕片觀察計數(shù)或制成干片，經(jīng)瑞氏染色后鏡檢，此為Et花環(huán)，t代表細(xì)胞總數(shù)。4、部分T細(xì)胞具有高度親和力的SRBC受體，當(dāng)SRBC與淋巴細(xì)胞按8:1混合，低速離心后不經(jīng)低溫放置，即能迅速形成E花環(huán)，稱為Ea花環(huán)。結(jié)果與分析凡能結(jié)合三個以上SRBC者即為E花環(huán)陽性細(xì)胞，計數(shù)200個淋巴細(xì)胞，算出花環(huán)形成細(xì)胞的百分率，Et花環(huán)正常值60%-80%。Ea花環(huán)正常值25%-40%注意事項(xiàng)1、試驗(yàn)用的SRBC要新鮮，脫纖維血4℃保存不超過10天。