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文檔簡(jiǎn)介
——生物制藥技術(shù)戊二胺的生物合成姓名:李治
戊二胺的簡(jiǎn)介和其生理作用及工業(yè)應(yīng)用戊二胺(Diaminopentane),又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺或尸毒素,是生物胺類(包括腐胺、精胺、亞精胺和尸胺等)中的一種。1885年,德國(guó)柏林的醫(yī)師布瑞哲在腐敗的尸體中首次發(fā)現(xiàn)該胺類,并以此得名尸胺。戊二胺是賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧產(chǎn)生的。
戊二胺在關(guān)閉孔蛋白通道和保護(hù)大腸桿菌免受氧的毒害方面也起著重要的作用;內(nèi)源性戊二胺的分泌以及胞內(nèi)高濃度戊二胺積累可導(dǎo)致外膜滲透性降低,抑制某些抗生素如頭孢霉素類抗生素的作用。在農(nóng)業(yè)上,外源施加戊二胺可以改善坐果和促進(jìn)果實(shí)發(fā)育,提高果實(shí)的產(chǎn)量;在醫(yī)學(xué)上,它也可作為一種有效治療痢疾的藥物;在工業(yè)上,戊二胺與二元酸進(jìn)行聚合反應(yīng)可合成優(yōu)質(zhì)高分子材料——新型尼龍。簡(jiǎn)述幾種戊二胺的合成方法戊二胺的制備方法主要可以分為兩大類:化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法?;瘜W(xué)合成法條件苛刻、污染環(huán)境,而生物轉(zhuǎn)化法過程復(fù)雜、成本較高。目前,利用基因工程技術(shù)構(gòu)造代謝工程菌來直接規(guī)?;苽淙祟愃璁a(chǎn)品是最經(jīng)濟(jì)、最環(huán)保和最有前途的方法,是代謝工程研究的方向和熱點(diǎn)。1.實(shí)驗(yàn)室的制備
采用戊二腈為原料,把戊二腈的無水乙醇溶液煮沸之后,快速加入金屬鈉,反應(yīng)完之后向其中加入水,蒸出乙醇,剩余反應(yīng)物采用過熱蒸汽蒸餾。蒸出的餾出物用稀鹽酸中和、蒸干,剩余物用冷無水乙醇洗滌,再用少量固體氫氧化鉀和水分解所得的鹽酸鹽,蒸去水,減壓蒸餾,即可得到戊二胺。西北大學(xué)李崇等人采用非晶態(tài)鎳催化劑在戊二腈上催化加氫來制備戊二胺,取得不錯(cuò)結(jié)果。
2.生物體直接提取法戊二胺是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿,雖然它在腐爛的尸體和精液中都可以分離得到,但是含量較低,不適合大量的生產(chǎn),而且也未曾有此方面的報(bào)道。3.微生物轉(zhuǎn)化法
微生物轉(zhuǎn)化法主要是利用底物賴氨酸在賴氨酸脫羧酶的催化下脫去羧基生成戊二胺。L-賴氨酸脫羧酶存在于E.coli、尸桿菌等大多數(shù)微生物中,一些高等植物中也有。日本太卡哈斯等通過游離大腸桿菌L-賴氨酸脫羧酶用D,L-賴氨酸作為底物以不對(duì)稱降解L-賴氨酸的方式得戊二胺和D-賴氨酸。該反應(yīng)步驟多,產(chǎn)物分離過程復(fù)雜,成本高,產(chǎn)率低(38%)。日本東麗尖端融合研究所用高效表達(dá)大腸桿菌來源的賴氨酸脫梭酶的大腸桿菌高效率生成戊二胺。4.微生物直接生產(chǎn)法
日本東麗尖端融合研究所通過對(duì)賴氨酸工業(yè)生產(chǎn)上所用的谷氨酸棒桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作,又開發(fā)了從葡萄糖生產(chǎn)戊二胺的技術(shù)。可以用高絲氨酸脫氫酶基因被破壞的、用來發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株為宿主,把來源于大腸桿菌的賴氨酸脫梭酶基因的表達(dá)單元插入高絲氨酸脫氫酶基因座。通過玻璃發(fā)酵罐的發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)15小時(shí)可以生產(chǎn)出2.5g/L戊二胺。目前,通過基因工程篩選得到的谷氨酸棒狀桿菌是生產(chǎn)戊二胺的最好菌株。生物法生產(chǎn)戊二胺需要解決的首要問題是提高該菌株對(duì)高濃度產(chǎn)物的耐受性。傳統(tǒng)化學(xué)催化合成戊二胺法
采用非晶態(tài)鎳催化劑、以無水乙醇為溶劑,在高壓反應(yīng)釜中進(jìn)行了戊二腈催化加氫制備戊二胺。非晶態(tài)鎳催化劑上戊二腈催化加氫制備戊二胺的反應(yīng)歷程為:首先戊二腈催化加氫生成5一氨基戊腈,然后5一氨基戊腈催化加氫生成目標(biāo)產(chǎn)物戊二胺和副產(chǎn)物六氫吡啶。經(jīng)查找文獻(xiàn)其最佳反應(yīng)條件為:非晶態(tài)Fe-Mo一Ni一Al催化劑用量15%、NaoH助催化劑用量0.25%、戊二腈與乙醇的體積比1:5、反應(yīng)壓力3Mpa、反應(yīng)溫度70℃的優(yōu)化反應(yīng)條件下,戊二睛的轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。(Lichong,etal.,2007,petrochemicaltechnology)發(fā)酵生產(chǎn)微生物代謝途徑及其發(fā)酵酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程目前最常用的微生物是大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌,已經(jīng)對(duì)戊二胺在細(xì)菌體內(nèi)的代謝過程進(jìn)行了深入研究。以大腸桿菌為例,在大腸桿菌體內(nèi),戊二胺是經(jīng)賴氨酸途徑合成的。賴氨酸由TCA循環(huán)產(chǎn)生的草酰乙酸和l分子丙酮酸、2分子氨、4分子NADPH(還原型輔酶II)作用,經(jīng)過10步反應(yīng)得到。首先,草酰乙酸經(jīng)氨基化合成天冬氨酸;然后,天冬氨酸在3種同工酶作用下,通過磷酸化轉(zhuǎn)化成天冬氨酰磷酸;天冬氨酸磷酸經(jīng)還原形成天冬氨酸半醛;天冬氨酸半醛與丙酮酸再經(jīng)6步反應(yīng)生成二氨基庚二酸,最后經(jīng)脫羧形成產(chǎn)物賴氨酸。
微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)尸胺的過程可分為菌體發(fā)酵培養(yǎng)過程(產(chǎn)酶過程)、底物與菌體轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程和產(chǎn)物尸胺的分離提取精制過程。日本東麗尖端融合研究所用高效表達(dá)大腸桿菌來源的賴氨酸脫羧酶高效率生成尸胺。其流程如下:(1)將大腸桿菌中cadA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后連入到pUC18中,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌大腸JM109菌株中,利用卡那霉素篩選出轉(zhuǎn)化子。(2)將E.coliJM109pcadA菌株在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),種子液接入的培養(yǎng)基中,在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng),培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)之后加入IPTG(溶于水中)誘導(dǎo),再繼續(xù)培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)離心來收集菌體,可得到濕菌體,再將底物和濕菌體加入到反應(yīng)器中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。并不斷向其中流加己二酸,目的是中和產(chǎn)生的戊二胺,使pH維持在6.0左右,尸胺轉(zhuǎn)化率可達(dá)到98%。(4)反應(yīng)液離心除去菌體,在上清液中加入活性炭并在20℃下攪拌進(jìn)行脫色,然后過濾除去活性炭,濾液再減壓濃縮。然后,在4℃冰箱中冷卻析出晶體。離心收集晶體,于減壓干燥器中干燥數(shù)天。(5)將所得干燥的晶體經(jīng)X射線衍射分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),晶體是按戊二胺:己二酸摩爾比為1:1的方式而形成的結(jié)晶,晶體純度達(dá)到99%或更高,可直接進(jìn)行聚合反應(yīng)生產(chǎn)尼龍。發(fā)酵液中戊二胺的提取和精制
先將發(fā)酵液中的細(xì)胞組分除去,然后經(jīng)過四步,即發(fā)酵液堿化、熱處理、有機(jī)萃取劑萃取、有機(jī)相分離戊二胺。堿化發(fā)酵液至pH>11,熱處理的目的是使乙?;?DAP水解,溫度選在90-110℃或在過壓下加熱到更高的溫度進(jìn)行熱處理。萃取劑選用偶極質(zhì)子性有機(jī)溶劑,如鏈烷醇或環(huán)烷醇,萃取過程和隨后的相分離過程在升溫條件下進(jìn)行。
從工業(yè)發(fā)酵肉湯中分離純化出戊二胺單體,并獲得較高的產(chǎn)量,可以使用快速萃取的純化方法。從發(fā)酵肉湯中分離純化提取戊二胺單體主要包括分離、絮凝、過濾等方法去除細(xì)胞;然后,加入氫氧化鈉、氫氧化鈣或氫氧化鉀來調(diào)節(jié)pH>12;隨后,通過加熱發(fā)酵肉湯來水解可能存在的副產(chǎn)物N-乙?;?二氨基戊烷;再使用在堿性環(huán)境下穩(wěn)定的有機(jī)溶劑(如正丁醇)進(jìn)行萃取,可得到戊二胺的粗產(chǎn)品。利用色譜、蒸餾或酸沉淀法將戊二胺純化,純化
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