月季的花藥培養(yǎng)

3.2月季的花藥培養(yǎng)知識(shí)回顧：練習(xí)：小麥高桿（D）對(duì)矮桿（d）為顯性，抗銹?。═）對(duì)不抗銹病（t）為顯性，現(xiàn)有高桿抗銹病和矮桿不抗病的兩種純合體，如何快速獲得矮桿抗銹病的純種？P：DdTt，高稈抗銹病DT，Dt,dT,dtddTT矮稈抗銹病↓雜交花藥離體培養(yǎng)DT，Dt,dT,dt↓秋水仙素處理高桿抗銹?。―DTT）×矮稈不抗銹?。╠dtt）

F1：的基因型和表現(xiàn)型：各種配子的種類：符合要求的單倍體的基因型：

良種的基因型表現(xiàn)型↓花藥離體培養(yǎng)單倍體植株（N）秋水仙素處理植株（2N）1.明顯縮短育種年限2.后代植株都為純合子正常植株（2N）單倍體育種的過(guò)程是什么？特點(diǎn)：一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）被子植物的花粉發(fā)育1、被子植物的花的結(jié)構(gòu)：花托花萼花瓣雄蕊花藥花絲雌蕊柱頭花柱子房被子植物子房的結(jié)構(gòu)胚珠的結(jié)構(gòu)卵細(xì)胞極核子房壁珠被珠孔植物的雙受精作用：花雄蕊雌蕊花藥花粉粒精子精子子房胚珠胚囊子房壁珠被卵細(xì)胞兩個(gè)極核受精卵受精極核胚胚乳種皮種子果皮果實(shí)有絲分裂有絲分裂1n1n2n1n3n2n2n2n2n胚是一個(gè)新個(gè)體的幼體（胚芽胚根子葉胚軸）小孢子母細(xì)胞小孢子花粉囊花藥花粉粒（雙核期）成熟花粉2、被子植物花粉的發(fā)育花粉是花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂而形成的。因此，花粉是單倍體的生殖細(xì)胞。①經(jīng)歷時(shí)期：四分體時(shí)期、單核期、雙核期小孢子四分體單核雙核②花粉粒的形成1花粉母細(xì)胞4個(gè)小孢子

(小孢子四分體)減數(shù)分裂有絲分裂1個(gè)花粉管細(xì)胞核1個(gè)生殖細(xì)胞核有絲分裂2個(gè)精子單核居中期單核靠邊期雙核期1個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞1個(gè)生殖細(xì)胞(2n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)(n)花粉粒花粉粒類型一個(gè)成熟的花粉粒即為雄配子體，有兩種情況：成熟的花粉粒中，只含花粉管細(xì)

胞核和生殖細(xì)胞核。（精子在花粉管

中形成）。有些植物的花粉，在成熟前，生

殖細(xì)胞進(jìn)行一次有絲分裂，形成兩個(gè)

精子，這樣的花粉在成熟時(shí)，含有一

個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和兩個(gè)精子。二核花粉粒:三核花粉粒:被子植物的雌蕊營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在花粉萌發(fā)過(guò)程中的作用：控制花粉的萌發(fā)并提供營(yíng)養(yǎng)例1：關(guān)于被子植物花粉發(fā)育的說(shuō)法，不正確的是（）A、花粉粒是在花藥中的花粉囊里形成的B、被子植物精子的形成是直接減數(shù)分裂的結(jié)果C、被子植物的花粉的發(fā)育要經(jīng)歷四分體時(shí)期、單核期、雙核期等階段D、花粉粒在發(fā)育過(guò)程中，核先位于細(xì)胞一側(cè)，再移到細(xì)胞中央BD（二）產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑①②移栽花藥中的花粉胚狀體脫分化愈傷組織花藥中的花粉脫分化分化

叢芽再分化

叢芽誘導(dǎo)生根體細(xì)胞胚（胚狀體）：在組織培養(yǎng)過(guò)程中，某些細(xì)胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榕c合子發(fā)育成的胚非常相似的結(jié)構(gòu)，發(fā)育過(guò)程亦與合子胚類似。體細(xì)胞體細(xì)胞胚類似合子發(fā)育成的胚的結(jié)構(gòu)（具有胚根、胚芽、胚軸等結(jié)構(gòu)）植物組織培養(yǎng)過(guò)程中單倍體性細(xì)胞花粉胚知識(shí)拓展①胚狀體②胚狀體的結(jié)構(gòu)及其發(fā)育過(guò)程與種子相似1、形成原因培養(yǎng)基中的激素種類及濃度配比2、植株的特點(diǎn)：?jiǎn)伪扼w植株，植株弱小，高度不育。思考：（1）為什么愈傷組織和胚狀體到叢芽分別稱為分化和再分化？胚狀體就像種子，有胚芽、胚軸、胚根等結(jié)構(gòu)。胚狀體到叢芽就是由原始的分化狀態(tài)繼續(xù)生長(zhǎng)和分化完成的。而愈傷組織形成叢芽的過(guò)程是從脫分化狀態(tài)進(jìn)入再分化形成叢芽的過(guò)程。（2）花粉植株弱小，高度不育，是否就沒(méi)有利用價(jià)值？用于單倍體育種技術(shù)，可明顯縮短育種周期，培育純合新品種。

煙草花藥培養(yǎng)胚狀體發(fā)育途徑：愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥愈傷組織發(fā)育途徑：（三）影響花藥培養(yǎng)的因素1、材料的選擇從花期看：月季的初花期從花粉發(fā)育時(shí)期看：?jiǎn)魏似趶幕ɡ倏矗和耆撮_(kāi)放的(可挑選到單核期的花藥，菌少、易消毒)選擇單核期以前的花藥接種，質(zhì)地幼嫩，極易破碎；選擇單核期之后的花藥接種，花瓣已有些松動(dòng)，又給材料的消毒帶來(lái)困難，且難以挑選到單核期的花藥。其它時(shí)期選擇的缺點(diǎn):2、培養(yǎng)基：花藥培養(yǎng)基所采用的培養(yǎng)基可能因植物的不同而有所變化。小麥為N6培養(yǎng)基，馬鈴薯、月季為MS培養(yǎng)基，油菜為B5培養(yǎng)基。3、其他因素親本植株的生長(zhǎng)條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種的密度等對(duì)誘導(dǎo)成功都有一定的影響思考：為什么花瓣松動(dòng)會(huì)給材料的消毒帶來(lái)困難？花瓣松動(dòng)后，微生物就可能侵入到花藥，給材料的消毒帶來(lái)困難。二、實(shí)驗(yàn)操作（一）材料的選取選擇花藥時(shí)一般通過(guò)鏡檢確定花粉發(fā)育時(shí)期，此時(shí)需要對(duì)花粉細(xì)胞核進(jìn)行染色。②某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色。①最常用的方法有醋酸洋紅法(將染色體染成紅色)1、方法①醋酸洋紅法染色機(jī)理醋酸洋紅為堿性染色劑，而花粉細(xì)胞內(nèi)有染色體，染色體主要成分是DNA和蛋白質(zhì),易被堿性染料著色染成紅色

。將體積分?jǐn)?shù)45％的醋酸100ml煮沸，緩緩加入1g洋紅，再加熱回流8h，冷卻至50℃，過(guò)濾即可。②醋酸洋紅的配置2、醋酸洋紅法將花藥放在載玻片上，加一滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％的醋酸洋紅，用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片在顯微鏡下檢查。③染色操作3、焙花青—鉻釩法將無(wú)水酒精與冰醋酸按體積比為3：1的比例混勻①卡諾氏固定液的配制方法

花藥應(yīng)該在卡諾氏固定液中固定20min，然后取出放在載玻片上，加焙花青—鉻釩溶液染色，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下檢查。這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色。將5g鉻明礬[K2SO4Cr2(SO4)·24H2O]加入90ml蒸餾水中，溶解后加入0.1g焙花青，混勻并加熱至沸騰，煮沸5分鐘后冷卻至室溫，過(guò)濾，加蒸餾水定容至100ml。②焙花青—鉻釩溶液的配制方法③染色操作（二）材料的消毒花蕾（70％酒精）大約30s（無(wú)菌水）清洗（無(wú)菌吸水紙）吸干

水分（1％氯化汞溶液）2～4min（無(wú)菌水）沖洗說(shuō)明：用于培養(yǎng)的花藥，實(shí)際上多數(shù)未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或穎片保護(hù)，通常處于無(wú)菌狀態(tài)，所以只要將整個(gè)花蕾或幼穗消毒即可。思考：月季花蕾的消毒與菊花外植體的消毒相比較，二者有何不同？在酒精消毒前，花藥不需要預(yù)先用流水沖洗、洗衣粉洗滌和軟刷刷洗。（三）接種和培養(yǎng)在無(wú)菌條件下除去萼片和花瓣用鑷子取出花藥②要徹底去除花絲，因?yàn)榕c花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成。

立即將花藥接種于培養(yǎng)基上，通常每瓶接種花藥7-10個(gè)。1、剝?nèi)』ㄋ帰傥饟p傷花藥，否則接種后容易從受傷部位產(chǎn)生愈傷組織。2、接種注意：①培養(yǎng)條件：溫度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。

3、培養(yǎng)②培養(yǎng)：一般經(jīng)過(guò)20-30天培養(yǎng)后，會(huì)發(fā)現(xiàn)花藥開(kāi)裂，長(zhǎng)出愈傷組織或釋放出胚狀體。長(zhǎng)出愈傷組織則將愈傷組織及時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株。③注意：如果花藥開(kāi)裂釋放出胚狀體，則一個(gè)花藥內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開(kāi)裂后盡快將幼小植株分開(kāi)，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開(kāi)。

在花藥培養(yǎng)中，特別是通過(guò)愈傷組織形成的花粉植株，常常會(huì)出現(xiàn)染色體倍性的變化（主要原因是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核融合造成的）。4、鑒定和篩選三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、選材是否恰當(dāng)2、無(wú)菌技術(shù)是否過(guò)關(guān)3、接種是否成功選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。如果出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，說(shuō)明某些操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾消毒或接種等有問(wèn)題。如果接種的花藥長(zhǎng)出愈傷組織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功了。要