第三章兔血清效價檢測(ELISA)

第三章兔血清效價檢測（ELISA）1一、實驗?zāi)康?/p>

了解酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzymelinkedimmunosorbent

assay,ELISA）的原理及優(yōu)點，學(xué)習(xí)ELISA的操作過程。2二、原理

抗原－抗體反應(yīng)的特異性

酶促反應(yīng)的高效性3二、原理

酶標(biāo)記抗體（或抗原）與固相載體上的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合后，加入底物，酶催化底物出現(xiàn)顏色反應(yīng)，顏色的深淺與抗原（或抗體）的量相關(guān)，用酶標(biāo)儀測定其吸光值進行定量分析。4二、原理（間接ELISA檢測抗體）A：包被抗原；B：加待檢血清；C：加酶標(biāo)二抗；D：加底物、顯色；E：終止、讀數(shù)ABCDE5二、原理

ELISA技術(shù)具有特異、敏感、結(jié)果判斷客觀、簡便和安全等優(yōu)點，在生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科中應(yīng)用廣泛。6二、原理

本次實驗以APP分泌到細(xì)胞外的天然毒素ApxIIA為檢測抗原，包被酶標(biāo)板，通過間接ELISA方法檢測兔血清中針對APP毒素的抗體。7三、材料

1.酶標(biāo)板：以ApxIIA天然毒素（抗原）包被的酶標(biāo)板（每人一排）

2.洗滌液：1×PBST

3.封閉液：5％脫脂牛奶

4.待檢樣品：免疫兔血清（一抗）8三、材料

5.二級抗體：HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG；

6.顯色液：TMB顯色試劑（ELISA用）

7.終止液：1％SDS9四、操作步驟

1.加稀釋液

在酶標(biāo)板第1管加190μl洗滌液，2～11孔加100μl洗滌液，12孔加97.5μl洗滌液。

10四、操作步驟

2.稀釋血清

在第一孔加待檢血清10μl，混勻后取100μl到第二孔，依次稀釋到第10孔，棄取100μl。

第11孔為空白，不加血清，第12孔加空白血清2.5μl，混勻。11四、操作步驟

3.溫浴

稀釋完成后，做好標(biāo)記，將酶標(biāo)板置于37℃反應(yīng)30min。12四、操作步驟

4.洗板

取出96孔酶標(biāo)板，甩去一抗液，每孔加洗滌液200μl，輕輕振蕩1min，拍干，重復(fù)洗滌操作3次。13四、操作步驟

5.加二抗

在酶標(biāo)板各孔加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1:5000稀釋）100μL，將酶標(biāo)板置于37℃反應(yīng)30min。14四、操作步驟

6.洗板

共洗滌5次。

7.加底物

在酶標(biāo)板各孔加入TMB顯色液100μl，避光室溫靜置10min。15四、操作步驟

8.加終止液

在各孔加終止液50μL。

9.讀數(shù)

在630nm波長下以第11孔為空白調(diào)零后，讀數(shù)。

16四、操作