第三章酶的分離與純化-2013-11-14-2-副本

Chapter3

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的提取、分離與純化掌握：沉淀分離的技術(shù)原理和操作要點(diǎn)；膜分離的技術(shù)原理與操作要點(diǎn)；層析分離的原理與操作要點(diǎn)；電泳分離的原理與操作要點(diǎn)；萃取分離的原理與操作要點(diǎn)。熟悉：細(xì)胞破碎的原理與方法；酶提取的定義與方法；離心分離的設(shè)備與方法；酶結(jié)晶的方法和條件控制。細(xì)胞破碎；酶的提??；酶的沉淀分離；離心分離；膜分離；層析分離；凝膠層析；親和層析；電泳分離；萃取分離；超臨界萃取。重點(diǎn)提示：核心概念：酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。胞內(nèi)酶胞外酶Contentsofchapter31.酶的分離純化策略2.細(xì)胞破碎3.酶的提取4.酶的分離方法5.酶的濃縮、干燥與結(jié)晶√3.1酶的分離純化策略1、基本原則1）首要原則：防止酶變性失活2）預(yù)防蛋白質(zhì)變性的方法和措施：（1）所有操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行。（2）pH合適。（3）減少泡沫產(chǎn)生。（4）加少量重金屬螯合劑。（5）添加特異性物質(zhì)，采用親和層析方法。（6）減少微生物及雜蛋白的存在。（7）適當(dāng)添加其他抑制蛋白質(zhì)降解的試劑。3.2細(xì)胞破碎通過各種方法使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞的技術(shù)過程。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動玻璃勻漿機(jī)機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿、表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理（參看課本85-88）一種從植物材料中提取超氧物歧化酶的方法：ａ．稱取植物材料，加入0.05mol/LＫ2ＨPO4溶液，搗碎勻漿，并壓榨過濾；ｂ．濾液中加入1/4體積4:4的乙醇:氯仿混合溶液，攪拌均勻，2000rpm離心20分鐘；ｃ．取上清液按15g/L加入K2HPO4攪勻，再加入0.6體積的丙酮，2000rpm離心20分鐘；ｄ．取上清液，加入1體積的丙酮，2200rpm離心20分鐘；ｅ．棄上清液，沉淀溶于于3mmol/L的磷酸緩沖液（pH7.5）中，并透析；ｆ．透析液用Sephadex-G75或G100進(jìn)行凝膠過濾，收集活性部分。方法舉例霉菌：較容易，通過機(jī)械剪切、研磨或者加入細(xì)胞壁溶解酶。細(xì)菌：少量采用超聲波破碎和溶菌酶處理，大量用丙酮干粉法，或用自溶法。酵母菌：細(xì)胞壁溶解酶處理法、稀鹽溶液振蕩法、冷熱破壁法。酶的提取：也稱為酶的抽提，指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。提取目標(biāo)：將目的酶最大限度地溶解出來。保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但要防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。提取原則：相似相溶。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。3.3酶的提取提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶1、酶的主要提取方法2、影響酶提取的主要因素1）溫度2）pH值3）提取液的體積酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。胞內(nèi)酶胞外酶3.4酶的分離方法1、沉淀分離（溶解度）2、離心分離（分子量，密度）3、過濾與膜分離（分子大小、形狀）4、層析分離（分子形狀、大小、分子量、電荷、吸附力等）5、電泳分離（電荷、分子量）6、萃取分離（溶解度）1、沉淀分離

通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法（中性鹽沉淀）利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離。等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。復(fù)合沉淀法（有機(jī)聚合物沉淀）在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離。選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離。（1）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度）鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。硫酸銨優(yōu)點(diǎn)：這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。缺點(diǎn)：緩沖能力較差，銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。

溶液中飽和硫酸銨的體積飽和度＝溶液的總體積（2）等電點(diǎn)沉淀（isoelectricprecipitation）

原理：蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低；不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)。

使用方法：單獨(dú)使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度。（3）有機(jī)溶劑沉淀法（降低介電常數(shù)）有機(jī)溶劑沉淀原理：主要是由于有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用的有機(jī)溶劑：丙酮、乙醇、甲醇、異丙醇等（2倍，70%）優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：

1）分辨率比鹽析法高。

2）沉淀不需脫鹽。

3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心。缺點(diǎn)：

1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活。

2）有機(jī)溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。影響有機(jī)溶劑沉淀的因素（1）溫度：低溫（0℃）操作。（2）pH值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。（3）離子強(qiáng)度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度目的防止蛋白質(zhì)變性（4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為5?20mg/ml（4）復(fù)合沉淀法（有機(jī)聚合物沉淀法）

原理：與有機(jī)溶劑類似

。

沉淀劑：多用聚乙二醇。優(yōu)點(diǎn)：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。（5）選擇性變性沉淀法定義：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。

方法：①熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。②pH變性等電點(diǎn)沉淀法是pH變性法中的一種變體。③有機(jī)溶劑變性使那些對有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。2、離心分離離心分離：借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。（1）離心機(jī)的選擇名稱轉(zhuǎn)速(r/min)注意事項(xiàng)酶分離純化中的用途低速離心機(jī)6000常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x高速離心機(jī)6000?25000冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡沉淀細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等超速離心機(jī)>25000冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化離心機(jī)操作平衡、定溫、定速、定時(shí)。（2）離心方法的選擇

差速離心法沉降速度法密度梯度離心沉降平衡法等密度梯度離心①差速離心（differentialcentrifugation）定義：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單。缺點(diǎn)：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。

2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。

3）沉降的顆粒受到擠壓。②密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）定義：樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。常用密度梯度溶液：蔗糖溶液。特點(diǎn)：

1）區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。

2）適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。③等密度梯度離心定義：又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。離心時(shí)，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏掀?，達(dá)到與其相同的密度時(shí)不再移動，形成區(qū)帶。

常用梯度介質(zhì)：氯化銫溶液。特點(diǎn)：

1）介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。

2）適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。密度梯度離心等密度梯度離心梯度介質(zhì)通常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降樣品通常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降樣品離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時(shí)間，高速度分離依據(jù)密度相近，但沉降系數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度不同沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)（3）離心條件的確定①離心力②離心時(shí)間③溫度和pHFc

=mac

＝mrω2

＝mr（2N/60）2

N：離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）；

Fc通常以相對離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。RCF=mr（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)3、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜過濾的分類及其特性

(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

)膜分離加壓膜分離微濾超濾反滲透電場膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴(kuò)散膜分離透析納濾（NF，Nanofiltration）：是一種介于反滲透和超濾之間的壓力驅(qū)動膜分離過程，流體靜壓差電場正負(fù)極小分子擴(kuò)散顆粒大小膜四種常用膜分離過程的截留特性根據(jù)膜材料和不同進(jìn)料液的特性，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。4、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的（稱為固定相），另一個(gè)相則流過此固定相（稱為流動相）并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離。分子的大小和形狀分子極性吸附力分子親和力分配系數(shù)……層析法的分類按兩相所處的狀態(tài)分類：按操作形式分類：按層析過程機(jī)理分類：液相層析液-固層析液-液層析氣相層析氣-固層析氣-液層析柱層析紙層析薄層層析

層析方法分離依據(jù)吸附層析吸附力分配層析分配系數(shù)離子交換層析離子交換凝膠層析相對分子質(zhì)量與形狀親和層析親和力層析聚焦等電點(diǎn)疏水層析疏水作用層析分離方法（P103-119）1）吸附層析（adsorptionchromatography）是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。吸附：被吸附物吸附到吸附劑的表面上。解吸：被吸附物離開吸附劑表面。

吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。溶劑洗脫法：采用單一或混合的溶劑進(jìn)行洗脫的方法。置換洗脫法：采用置換洗脫液進(jìn)行洗脫的方法。置換洗脫液：含有一種吸附力比被吸附組分更強(qiáng)的溶液。前緣洗脫法：又稱前緣分析法，連續(xù)向吸附層析柱中加入欲分離的混合溶液。分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)：指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，分配系數(shù)是一常數(shù)。紙上層析分配薄層層析分配氣相層析2）分配層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。3）離子交換層析（ionexchangechromatography，IEC）

按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。

陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì))

陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽離子交換劑：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3離子交換層析Ion-exchangechromatography凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。4）凝膠層析Size-exclusionchromatography常用的凝膠：

葡聚糖凝膠 瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠

上節(jié)課主要內(nèi)容酶分離純化的方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離鹽析沉淀法等電點(diǎn)沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法復(fù)合沉淀法選擇性變性沉淀法差速離心密度梯度離心等密度梯度離心粗濾微濾超濾納濾反滲透吸附層析分配層析離子交換層析凝膠層析親和層析層析聚焦凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi——內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve——某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時(shí)的洗脫液體積（ml）凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時(shí),即Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1時(shí),即Ve=Vo+Vi，說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部內(nèi)空隙，最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。Ve-VoKd=————Vi

分配系數(shù)Kd的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，

Kd差異小，分離效果差。常用的凝膠：

葡聚糖凝膠 瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠

凝膠型號顆粒大小/μm溶脹體積/(ml/g)分離范圍（Mr）SephadexG-10SephadexG-15SephadexG-25SephadexG-50SephadexG-75SephadexG-100SephadexG-150SephadexG-2004～1204～12050～15050～15040～12040～12040～12040～1202～32.5～3.54～69～1112～1515～2020～3020～30小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

型號使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）含瓊脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～1500001086421類型說明功能基反離子DEAE-SephadexA-25，A-50弱堿性陰離子交換劑二乙氨基己基氯QAE-SephadexA-25，A-50強(qiáng)堿性陰離子交換劑二乙氨基己基——2-羥丙基氯CM-SephadexC-25，C-50弱酸性陽離子交換劑羧甲基鈉SP-SephadexC-25，C-50強(qiáng)酸性陽離子交換劑磺丙基鈉離子交換葡聚糖5）親和層析親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物，酶與競爭性抑制劑，酶與輔助因子，抗原與抗體，酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段，RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等親和層析親和層析的四個(gè)要素根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性，親和層析可以分為：共價(jià)親和層析疏水層析金屬離子親和層析免疫親和層析染料親和層析凝集素親和層析生物大分子中的功能基團(tuán)與配基形成可逆共價(jià)鍵酶蛋白與配基發(fā)生疏水結(jié)合酶蛋白表面的某些氨基酸殘基與金屬離子親和結(jié)合抗原與抗體的特異結(jié)合需要核苷酸類物質(zhì)的某些輔酶與有些染料特異結(jié)合凝集素能與糖蛋白的殘基專一而又可逆結(jié)合6）層析聚焦（chromatofocusing）層析聚焦：將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的技術(shù)。交換劑：多緩沖離子交換劑緩沖體系：含有兩性電解質(zhì)載體的多緩沖溶液分離基礎(chǔ)：層析柱內(nèi)形成穩(wěn)定的pH梯度5、電泳分離（electrophoresis）電泳（electrophoresis）：帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳等電聚焦電泳

濾紙淀粉、纖維素、瓊脂等醋酸纖維等高分子物質(zhì)多孔凝膠兩性電解質(zhì)電泳及分子篩的雙重作用影響顆粒在電場中的移動速度的原因：顆粒本身所帶的凈電荷量；顆粒形狀和顆粒大?。浑妶鰪?qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件。連續(xù)電泳連續(xù)電泳：指電泳系統(tǒng)使用相同孔徑的凝膠和相同緩沖系統(tǒng)的樣品緩沖液、凝膠緩沖液和電極緩沖液，且pH值恒定，只是離子強(qiáng)度不同的區(qū)帶電泳。不連續(xù)電泳不連續(xù)電泳：指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳。由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品（即使是稀樣品）在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進(jìn)行分離。6、萃取分離萃取分離：利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個(gè)液相。有時(shí)也可采用其它流體。按照兩相的組成不同，萃取可以分為：有機(jī)溶劑萃取雙水相萃取超臨界萃取反膠束萃取水相和有機(jī)溶劑相互不相溶的兩個(gè)水相溶質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同反膠束1）有機(jī)溶劑萃取利用溶質(zhì)在水和有機(jī)溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離。萃取劑乙醇丙酮丁醇苯酚等2）雙水相萃取利用溶質(zhì)在兩個(gè)互不相容的水相中的溶解度不同而分離。①雙水相的形成：

雙水相體系：將兩種不同水溶性聚合物的水溶液混合時(shí)，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值時(shí)，體系會自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。

形成原因：聚合物的空間位阻作用，相互無法滲透，具有強(qiáng)烈的相分離傾向，在一定條件下即可分為兩相。

相分離的主要推動力：聚合物水溶液的疏水性差異各種雙水相系統(tǒng)聚合物P

聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖(Dex)，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉②萃取原理利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。當(dāng)生物分子進(jìn)入雙水相體系后，由于其表面性質(zhì)、電荷作用以及各種力（疏水鍵、氫鍵、離子鍵等）的存在，使其在上相和下相之間按其分配系數(shù)進(jìn)行選擇性分配。在很大的濃度范圍內(nèi)，要分離物質(zhì)的分配系數(shù)與濃度無關(guān)，而與被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)及特定的雙水相體系的性質(zhì)相關(guān)。特別適用于直接從含有菌體等雜質(zhì)的酶液中提取純化酶

幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實(shí)例酶菌種相系統(tǒng)延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/鹽天冬氨酸酶E.coliPEG/鹽-半乳糖苷酶E.coliPEG/鹽亮氨酸脫氫酶Bacillussp.PEG/Dex

乙醇脫氫酶Baker’syeastPEG/鹽青霉素?；窫.coliPEG/鹽3）超臨界萃?。ǔR界流體萃?。├糜蛛x物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。超臨界流體（SCF）：指在臨界溫度和臨界壓力以上的流體。某些超臨界流體的超臨界點(diǎn)和超臨界密度流體名稱臨界溫度(℃)臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳CO231.17.380.46二氧化硫SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑氣N2O36.57.170.451氟里昂C28.83.900.5784）反膠束萃取正膠束：表面活性劑溶于水中，使其濃度超過臨界膠束濃度，表面活性劑在水溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為正膠束。反膠束：表面活性劑溶于非極性溶劑中，使其濃度超過臨界膠束濃度，表面活性劑在有機(jī)溶劑中聚集在一起形成聚集體，稱為反膠束。（正）膠束反膠束形成表面活性劑溶于水，使其濃度超過臨界膠束濃度。表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過臨界膠束濃度。構(gòu)造表面活性劑極性基團(tuán)在外，非極性基團(tuán)在內(nèi)，形成非極性核心。表面活性劑非極性基團(tuán)在外，極性基團(tuán)在內(nèi)，形成極性核心，溶于水后，形成水池（w