第7章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征

Protein第7章

蛋白質(zhì)的分離純化和表征

蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點蛋白質(zhì)的等電點：當(dāng)溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中即不向陽極移動也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點（pI）。在等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。

蛋白質(zhì)電泳：在外液pH低于等電點的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負極移動；在外液pH高于等電點的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負電荷，在電場中向正極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳—帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)在等電點pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將不同帶電性質(zhì)和不同大小、形狀的蛋白質(zhì)分子進行分離純化。根據(jù)蛋白質(zhì)凈電荷的差異來分離蛋白質(zhì)的一種方法是電泳法。電泳

蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬至一百萬道爾頓之間

1道爾頓＝1×C12絕對質(zhì)量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白質(zhì)分子的大?。ㄒ唬└鶕?jù)化學(xué)組成測定最小分子量1、測定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個鐵原子最低相對分子質(zhì)量=100*55.8/鐵的百分含量（二）SDS－PAGE測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒電泳時遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵（三）凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)混合樣凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測量三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成直徑1-100nm之間的顆粒，已達到膠體顆粒范圍的大小，因而具有膠體溶液的通性。蛋白質(zhì)的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因：１、蛋白質(zhì)多肽鏈上含有許多極性基團。如：－NH3＋、－COO－、－OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當(dāng)與水接確時，極易吸附水分子，使蛋白質(zhì)顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。2、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在非等電狀態(tài)時，相同蛋白質(zhì)顆粒帶有同性電荷，與周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層與雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。透析法：以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透析法半透膜：只允許溶劑小分子通過，而溶質(zhì)大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等二.蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對的。如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。蛋白質(zhì)沉淀定義：蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀下來，此現(xiàn)象即為蛋白質(zhì)的沉淀作用。（一）可逆沉淀定義：在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。1.

鹽析

在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。

而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機理：

破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。

各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分散沉淀析出，這種方法稱為分段鹽析。2.弱酸或弱堿沉淀法(等電點沉淀）

用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點處，使蛋白質(zhì)沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機理：

破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。酸酸堿堿堿酸溶液中蛋白質(zhì)的聚沉3.

有機溶劑沉淀法：

在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。有機溶劑沉淀法的機理：

破壞蛋白質(zhì)的水化膜。注意：有機溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。（二）不可逆沉淀定義：在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀（次級鍵）、強酸堿沉淀（影響電荷）、重金屬鹽沉淀（Hg2+、Pb2+

、Cu2+、Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。4.重金屬鹽沉淀(條件：pH稍大于pI為宜)

當(dāng)pH稍大于pI時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷這樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬沉淀法的機理：重金屬鹽加入之后，與帶負電的羧基結(jié)合。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進行解救。

5.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）

生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。（小檗堿、麻黃堿、嗎啡）能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。

生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機理：

在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。例如：“柿石癥”

吃柿子小心胃結(jié)石！年齡偏大的人，消化功能減退，多食易得柿石病?？崭挂膊灰喑允磷?。如果連皮一起吃更容易形成胃結(jié)石，皮中含的鞣酸更多。含高蛋白的蟹、魚、蝦在鞣酸的作用下，很易凝固成塊，形成胃結(jié)石。6.加熱變性沉淀法

幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽促進蛋白質(zhì)加熱凝固。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速.

如：煮雞蛋鹵水點豆腐（少量MgCl2加入到大豆蛋白質(zhì)的濃熱溶液中）四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.前處理：因動/植物/細菌而異2.粗分級分離：采用鹽析/等電點沉淀/有機溶劑分級分離等方法3.細分級分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶五、蛋白質(zhì)的分離純化方法(一)根據(jù)分子大小不同的純化方法

1、透析和超過濾利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機透析液加壓血液2、密度梯度（區(qū)帶）離心60000~80000轉(zhuǎn)/分重力60萬～80萬倍3、凝膠過濾（二）利用溶解度差別的純化方法1.等電點沉淀調(diào)整溶液pH

不同蛋白在各自pI處依次沉淀

2.鹽溶和鹽析3.有機溶劑分級分離法降低介電常數(shù)爭奪水化膜（三)根據(jù)電荷不同的分離