第1章色譜法引論

分離方法氣相色譜法gaschromatography,

GC氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用GC-MS高效液相色譜

highperformanceliquidchromatography,

HPLC分離分析中的新技術(shù)毛細(xì)管電泳capillaryelectrophoresis,CE色譜法分離原理概述及分類有關(guān)的術(shù)語色譜法的基本理論分離度定性和定量分析色譜法chromatography與蒸餾，重結(jié)晶，溶劑萃取，化學(xué)沉積及電解沉積法一樣，也是一種分離技術(shù)。特別適宜分離多組分的試樣，是各種分離技術(shù)中效率最高和應(yīng)用最廣的一種方法。最早創(chuàng)立色譜法的是俄國(guó)植物學(xué)家茨維特Tsweet將填入玻璃柱內(nèi)靜止不動(dòng)的一相固相或液相稱為固定相自上而下運(yùn)動(dòng)的一相一般是氣體，液體或超臨界流體稱為流動(dòng)相裝有固定相的柱子玻璃或不銹鋼稱為色譜柱概述及分類分離植物色素實(shí)驗(yàn)色譜法是一種物理、化學(xué)的分離、分析方法。利用混合物各組分在互相接觸的固定相和流動(dòng)相中有不同的分配比（或不同的吸附能力），當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些組分在兩相中進(jìn)行多次反復(fù)分配平衡（或吸附或解吸），從而使各組分得到分離，然后按順序被檢測(cè)。色譜的分類按照分離過程中相系統(tǒng)的形式和特征

柱色譜法

平板色譜法填充柱色譜法毛細(xì)管色譜法

紙色譜法

薄層色譜法1依據(jù)色譜過程中流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)氣相色譜法液相色譜法超臨界流體色譜法氣固色譜法氣液色譜法液固色譜法液液色譜法2流動(dòng)相固定相按色譜動(dòng)力學(xué)過程迎頭色譜頂替色譜洗脫色譜

線性洗脫色譜

非線性洗脫色譜34按所利用的物理化學(xué)原理吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠滲透色譜形成絡(luò)合物色譜色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語基線是柱中僅有流動(dòng)相通過時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)的記錄值。峰高:色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示。保留值:1死時(shí)間tM，不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)

2保留時(shí)間tR，試樣從進(jìn)入開始到柱后出現(xiàn)峰極大值3調(diào)整保留時(shí)間t'R=tR

－tM

4分配比k，也稱容量因子。為組分在固定相和流動(dòng)相中分配量之比,k=p/q=t'R

/tM

。（5）保留體積VR：組分從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所通過的載氣體積（ml）。

VR=tR*FCFC為校正到柱溫、柱壓下，載氣在柱內(nèi)的平均流速死體積VM：色譜柱內(nèi)除了填充固定相以外的空隙體積。

VM=tM*FC

調(diào)整保留體積VM′：扣除死體積后的保留體積。

VR′=tR′*FC=VR―VM（6）相對(duì)保留值（r2?1）：組分２的調(diào)整保留值與組分１的調(diào)整保留值之比。

r2?1可用來表示色譜柱即固定相的選擇性，又稱選擇因子。r2?1值越大，兩組分的tR′相差越大，分離越好，r2?1=1時(shí)，兩組分不能分離。相對(duì)保留值的特點(diǎn)：r2?1只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相無關(guān)。因此，它是GC中廣泛使用的定性依據(jù)。（7）區(qū)域?qū)挾?是組分在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。度量法有:標(biāo)準(zhǔn)偏差；半峰寬W1/2；基線寬度Y。標(biāo)準(zhǔn)偏差：0.607倍峰高處色譜峰寬的一半；半峰寬W1/2：峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬度；

W1/2=2.354基線寬度W:色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距。

W=4（8）分配系數(shù)K樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間發(fā)生的反復(fù)多次的吸附、脫附和溶解、揮發(fā)的過程，叫做分配過程。分配系數(shù)K：在一定溫度下，組分在兩相之間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比，是色譜分離的依據(jù)

分配系數(shù)是由組分和兩相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的。在一定溫度下，各物質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)是不同的。具有小的分配系數(shù)的組分，每次分配后，在氣相中的濃度較大，較早地流出色譜柱；而分配系數(shù)大的組分，由于每次分配后，在氣相中的濃度較小，較晚流出色譜柱。當(dāng)分配次數(shù)足夠多時(shí)，就能將不同的組分分離開來。相比，反映各種色譜柱柱型的特點(diǎn)分配比也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)，不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。對(duì)兩組分的選擇因子，兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。⑴分配系數(shù)是組分在兩相中的濃度比，分配比則是組分在兩相中分配總量之比。它們都與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，并隨柱溫、柱壓的變化而變化。⑵分配系數(shù)只決定于組分和兩相性質(zhì)，與兩相體積無關(guān)。分配比不僅決定于組分和兩相性質(zhì)，且與相比有關(guān)。⑶對(duì)于一給定色譜體系，組分的分離最終決定于組分在兩相中的相對(duì)量，而不是相對(duì)濃度，因此，分配比是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的重要參數(shù)，k值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。色譜流出曲線可以得到的重要信息根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷試樣中所含組分的最少個(gè)數(shù)。根據(jù)色譜峰的保留值或位置，可以進(jìn)行定性分析。根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析。色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)。色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相和流動(dòng)選擇是否合適的依據(jù)。塔板理論塔板理論假設(shè)：⑴在每塊塔板上，兩相間的分配平衡是瞬間建立的，因此定義達(dá)到分配平衡的一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H，因而理論塔板數(shù)n=L/H⑵載氣進(jìn)入色譜柱，不是連續(xù)的，而是脈動(dòng)的，每次進(jìn)氣量為一個(gè)板體積△V。⑶試樣開始時(shí)所有組分都加在第0號(hào)塔板上，且試樣在色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略不計(jì)。⑷分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)，與組分的量無關(guān)。為簡(jiǎn)單起見，設(shè)色譜柱為5塊塔板（n=5）組成，并以r表示塔板編號(hào)r=0、1、2、3、4，某組分在兩相間的分配系數(shù)K=1，設(shè)該組分進(jìn)樣量為1000μɡ，根據(jù)上述假設(shè)，在色譜分離過程中該組分在各塔板上的分配如下：?jiǎn)我唤M分在色譜柱內(nèi)的分配過程。若試樣為多組分混合物，則經(jīng)過很多次的分配平衡后，如果各組分的分配系數(shù)有差異，則在柱出口處出現(xiàn)最大濃度時(shí)所需的載氣板體積數(shù)亦將不同。由于色譜柱的塔板數(shù)相當(dāng)多，因此，分配系數(shù)有微小差別，仍可獲得好的分離效果。

塔板理論導(dǎo)出理論塔板數(shù)的公式：峰越窄，n越多，H越小，此時(shí)柱效能越高，因而n或H可作為描述柱效能的一個(gè)指標(biāo)。消除了死時(shí)間的影響

優(yōu)點(diǎn)：（1）描述了溶質(zhì)在色譜柱內(nèi)的分配平衡和分離過程（2）解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，提出評(píng)價(jià)柱效的方法缺點(diǎn)：（1）該假設(shè)不符合柱內(nèi)實(shí)際發(fā)生的分離過程（2）無法解釋譜帶擴(kuò)寬的原因和影響板高的因素（3）不能解釋不同流速具有不同的塔板高度總結(jié)速率理論吸收了塔板理論中板高的概念，并同時(shí)考慮影響板高的動(dòng)力學(xué)因素，指出:填充柱的柱效受渦流擴(kuò)散，分子擴(kuò)散，傳質(zhì)阻力，流動(dòng)相的流速等因素的控制，從而較好地解釋了影響板高的各種因素。vanDeemter

速率理論方程指出了色譜柱填充的均勻程度，填料粒度的大小，流動(dòng)相的種類及流速，固定相的液膜厚度對(duì)柱效的影響。板高渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)流速⑴渦流擴(kuò)散項(xiàng)（A）

A=2λdp式中dp為填充物的平均直徑，λ為填充不規(guī)則因子。因此，A與流動(dòng)相的性質(zhì)及線速度無關(guān)。結(jié)論：①使用粒度細(xì)及顆粒均勻的填料。②均勻填充。⑵分子擴(kuò)散項(xiàng)（B）式中Dg為組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)，它除與組分的性質(zhì)有關(guān)外，還與組分在柱中的停留時(shí)間、載氣的性質(zhì)、柱溫等因素有關(guān)。γ指填充柱內(nèi)氣體擴(kuò)散路徑彎曲的因素（彎曲因子）。結(jié)論：①采用較高的載氣流速。②控制較低的柱溫。③使用相對(duì)分子量較大的載氣，如因N2為分子量大，縱向擴(kuò)散?、莻髻|(zhì)阻力相C傳質(zhì)阻力系數(shù)C=氣相傳質(zhì)阻力Cg+液相傳質(zhì)阻力Cl結(jié)論：①采用粒度小的填充物。②采用相對(duì)分子量小的氣體作載氣，可減小Cg，提高柱效。結(jié)論：①降低固定相的含量，以降低液膜厚度。②采用比表面積較大的載體來降低液膜厚度。③控制適當(dāng)?shù)闹鶞?。范第姆特方程式?duì)選擇色譜分離條件具有指導(dǎo)意義。它指出了色譜柱填充的均勻程度、填料粒度的大小、流動(dòng)相的種類及流速、固定相的液膜厚度等對(duì)柱效的影響。液膜厚度（4）載氣流速對(duì)板高的影響由范第姆特方程H=A+B/U+CU繪制的H——U曲線，曲線的最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的塔板高度最小，該點(diǎn)的流速為流動(dòng)相的最佳流速。

塔板高度與載氣線速度的關(guān)系為了縮短分析時(shí)間，往往使流速稍高于最佳流速思考題：1、對(duì)某一組分來說，在一定的柱長(zhǎng)下，色譜峰的寬與窄主要取決于組分在色譜柱中的（1）保留值（2）擴(kuò)散速度（3）分配比（4）理論塔板數(shù)2、使用填充柱，當(dāng)固定液含量較高、載氣線速中等時(shí)，其塔板高度的主要控制因素是什么？3、固定相填充的均勻程度主要影響（1）渦流擴(kuò)散（2）分子擴(kuò)散（3）氣相傳質(zhì)阻力（4）液相傳質(zhì)阻力分離度柱效和選擇性理論塔板數(shù)n(n有效)是衡量柱效的指標(biāo)，反映了色譜分離過程動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。選擇性反映色譜分離的熱力學(xué)過程。常用色譜圖上兩峰間的距離衡量色譜柱的選擇性，其距離越大說明柱子的選擇性越好。柱子的選擇性主要取決于組分在固定相上的熱力學(xué)性質(zhì)。(α)分離度也稱分辨率(resolution,Rs)。既能反映柱效率又能反映選擇性的指標(biāo)，稱為總分離效能指標(biāo)，用相鄰兩色譜峰保留值之差與兩峰底寬平均值之比表示當(dāng)Rs<1時(shí)，兩峰總有部分重疊；當(dāng)Rs=1時(shí)，兩峰能明顯分離；當(dāng)Rs=1.5時(shí)，分離程度可達(dá)99.7%，兩峰已完全分離。當(dāng)然，更大的值分離效果會(huì)更好，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。值越大，相鄰兩組份分離越好分離度受柱效n,選擇因子和容量因子k的控制第一項(xiàng)稱熱力學(xué)因素，第二項(xiàng)稱動(dòng)力學(xué)因素，第三項(xiàng)稱容量因素基本色譜分離方程式1.的大小與兩組分的性質(zhì)有關(guān)一般可以用如下的方法來調(diào)節(jié):

改變流動(dòng)相的組成，包括改變pH

改變固定相的組成改變柱溫采用特殊的化學(xué)效應(yīng)2.增加塔板數(shù)，可以增加分離度3.容量因子k取決于組分和色譜柱兩者的性質(zhì)

加大容量因子可以增加分離度，但是會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，甚至造成譜帶檢測(cè)困難。常常通過改變柱溫或流動(dòng)相的組成，將k控制在15之間。影響因素例1：有一根1米長(zhǎng)的柱子，分離組分1和2，得到色譜圖。若欲得到R=1.2的分離度，有效塔板數(shù)應(yīng)為多少？色譜柱要加到多長(zhǎng)？1、用3米長(zhǎng)的柱子分離A、B、C三個(gè)組分，A是不被保留組分，它們的保留時(shí)間分別是1.0分、16.4分、17.0分，B、C組分的峰底寬為1.0分，求該柱的分離度。2、在一根已知有8100塊理論塔板的色譜柱上，異辛烷和正辛烷的調(diào)整保留時(shí)間為800s和815s，設(shè)(1+k)/k≈1，試問（1）如果一個(gè)含有上述兩組分的樣品通過這根柱子，所得到的分離度為多少？（2）假定調(diào)整保留時(shí)間不變，當(dāng)使分離達(dá)到1.0時(shí)，所需的塔板數(shù)為多少？3、當(dāng)色譜柱溫為150℃時(shí)，其vanDeemter方程中的常數(shù)A=0.08cm，B=0.15cm2/s，C=0.03s，這根柱子的最佳流速為多少？所對(duì)應(yīng)的最小塔板高度為多少？練習(xí)：4、在某色譜分析中得到下列數(shù)據(jù)：保留時(shí)間tR為5.0min，死時(shí)間t0為1.0min，液相體積為2.0ml，柱出口載氣流速F0為50ml/min。計(jì)算：（1）死體積；

（2）保留體積（3）分配系數(shù)5、在一個(gè)3米長(zhǎng)的色譜柱上，分離一個(gè)樣品的結(jié)果如下：組分1的保留時(shí)間為14分，組分2的保留時(shí)間為17分，死時(shí)間和兩組份的峰高都為1分，求（1）兩組份的調(diào)整保留時(shí)間；（2）用組分2求色譜柱的有效塔板數(shù)及有效塔板高度；（3）兩組分的容量因子；（4）相對(duì)保留值和分離度；（5）若使兩組份的分離度為1.5，問所需要的最短柱長(zhǎng)是多少。1、利用已知純物質(zhì)的對(duì)照法定性在一定的固定相和一定的操作條件下，任何物質(zhì)都有確定的保留值。將已知純樣品與待測(cè)試樣在相同條件下進(jìn)行色譜分析，用TR、VR作指標(biāo)（tM、VM固定不變），若二者相同可能是同一物質(zhì)。保留值相同，而峰形不同，仍然不能認(rèn)為是同一物質(zhì)。定性和定量分析色譜定性分析峰高加入法峰高加入法是將已知純樣品加入待測(cè)組分后，再進(jìn)行分析。若某組分峰比不加已知物時(shí)增高了。而半峰寬并不相應(yīng)增加，則證明加入的已知物質(zhì)與樣品中的某一組分為同一物質(zhì)。應(yīng)注意，在同一根色譜柱上用保留值鑒定組分有時(shí)不一定可靠。這是因?yàn)?，不同物質(zhì)有可能在同一根色譜柱上具有相同的保留值，所以應(yīng)采用雙柱或多柱法進(jìn)行定性分析，即采用采用兩根或多根性質(zhì)不同的色譜柱進(jìn)行分離，觀察未知物與標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留值是否始終重合。2、利用文獻(xiàn)保留數(shù)據(jù)進(jìn)行定性相對(duì)保留值法如果采用被測(cè)物與另一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)保留值來定性，則某些操作條件的影響可相互消除。ris僅與柱溫、固定液性質(zhì)有關(guān)，與其它條件無關(guān)。具體方法：從文獻(xiàn)上查得有關(guān)物質(zhì)的相對(duì)保留值數(shù)據(jù)，注意這些數(shù)據(jù)是用什么固定液和在什么柱溫下測(cè)定的，然后在相同的固定液和柱溫下實(shí)驗(yàn)，如兩者一致，一般是同一種物質(zhì)。利用文獻(xiàn)保留指數(shù)定性保留指數(shù)是指組分的保留行為，用兩個(gè)緊密相連的基準(zhǔn)物（一般是兩個(gè)正構(gòu)烷烴）來標(biāo)定。式中：XNi、XNZ、XN(Z+1)分別為待測(cè)物、具有Z個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴、具有（Z+1）個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值。要求：XNZ<XNi<XN(Z+1)，即未知峰應(yīng)在兩峰之間。3、用經(jīng)驗(yàn)規(guī)律和文獻(xiàn)值進(jìn)行定性分析碳數(shù)規(guī)律沸點(diǎn)規(guī)律在一定溫度下，同系物的調(diào)整保留時(shí)間的對(duì)數(shù)與分子中碳原子數(shù)呈線性關(guān)系，即：如果知道某一同系物中兩個(gè)或更多組分的調(diào)整保留值，則可根據(jù)上式推知同系物中其他組分的調(diào)整保留值。如果知道某一同系物中兩個(gè)或更多組分的調(diào)整保留值，則可根據(jù)上式推知同系物中其他組分的調(diào)整保留值。同族具有相同碳數(shù)碳鏈的異構(gòu)體化合物，其調(diào)整保留時(shí)間的對(duì)數(shù)與它們的沸點(diǎn)呈線性關(guān)系，即：4、與其它方法相結(jié)合的定性分析法與質(zhì)譜、紅外光譜等儀器相結(jié)合與化學(xué)方法配合進(jìn)行定性分析較復(fù)雜的混合物經(jīng)色譜柱分離為單組分，再利用質(zhì)譜、紅外光譜或核磁共振等儀器進(jìn)行定性鑒定。利用化合物具有的某些官能團(tuán)的特性，經(jīng)過特殊試劑處理，發(fā)生物理化學(xué)或化學(xué)反應(yīng)后，其色譜峰將會(huì)消失、提前或移后，比較處理前后色譜峰的差異，可初步辨認(rèn)官能團(tuán)的存在。氣相色譜定量分析在一定操作條件下，被分析組分i的重量mi或其在載氣中的濃度是與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)（峰高h(yuǎn)i或峰面積Ai）成正比。色譜定量分析的基礎(chǔ)要想正確進(jìn)行分析，需要解決三個(gè)問題：準(zhǔn)確測(cè)定峰面積或峰高；準(zhǔn)確求出比例系數(shù)；選擇合適的定量方法。1、峰面積或峰高的測(cè)量對(duì)稱形峰——峰高乘半峰寬法不對(duì)稱形峰——峰高乘平均峰寬法2、校正因子相對(duì)重和相對(duì)峰面積表組分真實(shí)配制（mi%）TCDFIDAi(cm2)Ai%Ai(cm2)Ai%乙醇501.5557.070苯501.23463.030？？？為了使檢測(cè)器產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)能真實(shí)地反映物質(zhì)的含量，就要對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行校正，引入了“定量校正因子”的概念。絕對(duì)校正因子在一定操作條件下，進(jìn)樣量與響應(yīng)信號(hào)成正比關(guān)系，即

mi=fi*Ai

或fi=mi/Ai式中fi稱為絕對(duì)校正因子。fi的物理意義：產(chǎn)生單位峰面積所需物質(zhì)的量，它主要由儀器的靈敏度及操作條件決定。當(dāng)mi的單位用g/l時(shí)，fi稱為絕對(duì)重量校正因子。當(dāng)mi的單位用mol/l時(shí)，fi稱為絕對(duì)摩爾校正因子。當(dāng)mi的單位用ml/l時(shí)，fi稱為絕對(duì)體積校正因子。相對(duì)校正因子fis指組分i與基準(zhǔn)組分s的絕對(duì)校正因子之比當(dāng)fi為重量校正因子時(shí)，當(dāng)fi為摩爾校正因子時(shí)，當(dāng)fi為體積校正因子時(shí)，無因次量，但它的數(shù)值與組分所采用的計(jì)量單位有關(guān)相對(duì)響應(yīng)值檢測(cè)器的響應(yīng)值（靈敏度）指一定量組分mi通過檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的信號(hào)大小。相對(duì)響應(yīng)值與校正因子只與試樣、基準(zhǔn)物質(zhì)以及檢測(cè)器類型有關(guān)，而與操作條件如柱溫、載氣流速、固定液性質(zhì)等無關(guān)。因而它們是一個(gè)能通用的常數(shù)。相對(duì)校正因子的測(cè)量方法：①準(zhǔn)確稱量被測(cè)組分和基準(zhǔn)物質(zhì)，混合后，在實(shí)驗(yàn)條件下分析，通過公式計(jì)算求得。熱導(dǎo)池檢測(cè)器用苯作基準(zhǔn)，氫火焰離子化檢測(cè)器用正庚烷作基準(zhǔn)。②在定量分析中，也可引用文獻(xiàn)發(fā)表的相對(duì)校正因子值，但以后的分析時(shí)，應(yīng)盡可能使操作條件與文獻(xiàn)上測(cè)定條件一致。③通過相對(duì)響應(yīng)值求得。例：將純苯與某組分A配成混合液，進(jìn)行氣相色譜分析，苯的樣品量為0.435μg時(shí)，峰面積為4.00cm2，組分A的樣品量為0.653μg時(shí)的峰面積為0.50cm2，求組分A以苯為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)的相對(duì)校正因子。3、定量方法歸一化法條件：當(dāng)樣品中各組分都能流出色譜柱，并在色譜圖上能一一出峰，且各峰分離清晰，這樣可把各組分的百分含量之和按100%計(jì)算。各組分百分含量：分析同系物時(shí)，各組分的fis相近優(yōu)點(diǎn)：①簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確；②操作條件變化時(shí)，對(duì)分析結(jié)果