病毒感染檢查方法

病毒感染檢查方法一、標本采集與送檢原則：1.盡早采?。喊l(fā)病初期2.部位適宜：由感染部位采取3.冷藏速送：裝有冰塊或干冰的容器內(nèi)（一）供分離病毒、檢出核酸及抗原的標本（二）檢測特異性抗體的標本采集雙份血清病毒材料采集與檢驗結果的關系采取標本的時期檢查病毒及其成分測定抗體潛伏期及前驅期剛發(fā)病或急性期恢復期及康復期較難查見最多查見很難查見未增多未增多或增多不明顯明顯增多（常超過4倍）病毒分離是診斷病毒感染的金標準，一旦陽性，即可確診。不適用于快速診斷，操作復雜，實驗成本高，陽性檢出率低等有時不得不分離病毒，例如發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒病，必須分離病毒進行研究，或者分離株的鑒定對流行病學有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望獲得天然弱毒株等。二、常規(guī)分離與鑒定（一）病毒分離標本采集殺滅雜菌（青鏈霉素）接種鑒定病毒種型易感動物出現(xiàn)病狀雞胚病變或死亡細胞培養(yǎng)細胞病變?nèi)蠓椒ǎǘ┎《捐b定1.形態(tài)學鑒定觀察CPE。常見的細胞形態(tài)學變化為細胞變圓、壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體。正常細胞病變細胞感染細胞具有吸附紅細胞的能力感染細胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細胞的作用2.血吸附和血凝作用紅細胞吸附正常細胞（1）血吸附作用吸附試驗可通過特異抗血清抑制來達到鑒定具有吸附特性的病毒（2）血凝作用血凝試驗血凝抑制試驗（3）病毒成分的直接檢測用免疫學或分子生物學技術直接檢查感染細胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。三、電子顯微鏡檢查病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結構等必須借助電子顯微鏡進行檢查。對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。透射電子顯微鏡1.正染法：超薄切片法取材固定戊二醛四氧化鋨清洗與脫水浸透包埋聚合切片染色鈾染鉛染雞痘病毒（超薄切片）超薄切片法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程缺點：操作復雜，費時，但標本可長時間保存2.負染技術負染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外周的電子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。銅網(wǎng)樣品濾紙染液（常用磷鎢酸）1-2分鐘后電鏡觀察口蹄疫病毒的電鏡負染負染法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：快速簡易（10-20min）；分辨率高；圖象清晰地病毒結構缺點：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有樣品應處于懸浮狀態(tài)免疫電鏡技術是將抗原抗體反應的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結合，在亞細胞和超微結構水平上對抗原物質進行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。3.免疫電鏡技術(Immuneelectronmicroscopy，IEM)（1）免疫凝集電鏡技術抗原與抗體凝集反應后，可使標本中病毒顆粒聚集成團，再經(jīng)負染直接在電鏡下觀察，提高了敏感性，確定病毒的血清學性質。（2）免疫電鏡定位技術特異性抗體用電子致密物質，如鐵蛋白、過氧化物酶等標記后，使之與組織超薄切片中的抗原結合，在電鏡下觀察到標記物所在位置，即為抗原抗體反應的部位。酶標記染色四、血清學試驗是一種常用的診斷病毒病的方法?？刹捎肊LISA、瓊脂擴散、中和試驗、標記抗體技術等免疫血清學方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。virus1.中和反應觀察特異性抗體能否保護易感的試驗動物防止死亡，能否抑制病毒的細胞病變效應。2.補體結合反應AgAb紅細胞溶血素補體AbAg紅細胞補體溶血素溶血（-）不溶血（+）待檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)3.瓊脂擴散4.標記抗體技術根據(jù)抗原抗體結合的特異性和標記分子的敏感性建立的技術，稱為標記抗體技術（labelledantibodytechnique）。熒光抗體標記技術酶標抗體技術同位素標記抗體技術酶標抗體技術免疫酶組化法冰凍切片上進行酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）酶標反應板上進行Ag+AbE

Ag-AbE+底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物Ag+Ab+AAbE+底物（1）間接ELISA（待檢）Ab+Ag+AbE+底物（2）夾心ELISA（待檢）3′3′5′5′3′3′3′3′3′3′5′5′5′5′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′模板DNA雙鏈延伸（形成新的雙鏈DNA）退火變性五、分子生物學技術聚合酶鏈反應（PCR）模板DNA引物（模板片段兩端的序列）DNA聚合酶體外核酸擴增系統(tǒng)，類似于體內(nèi)DNA復制過程2.核酸雜交技術核酸探針（probe）是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段，可檢測待檢樣品中特定的基因順序。標本滴加硝酸纖維素膜加熱和堿處理變性標記的核酸探針雜交放射自顯影或其他技術檢測六、感染組織的組織學檢查病毒在光學顯微