菌種選育、保藏與復壯2

五、原生質體融合定義：

通過酶解作用將兩個親株的細胞壁去除，在高滲條件下釋放出只有原生質膜包被著的球狀原生質體。然后將兩親株的原生質體在高滲條件下混合，加入融合促進劑聚乙二醇、仙臺病毒或電融合等助融，使它們相互凝集。通過細胞質融合，促使兩套基因組之間的接觸、交換、遺傳重組，在適宜條件下使細胞壁再生，在再生的細胞中獲得重組體。(1)(1)(2)(3)(4)原生質體的融細胞雜交原生質體融合回本章目錄（一）原生質體融合技術的特點1、重組頻率較高2、受接合型或致育性的限制較小3、重組體種類較多4、遺傳物質的傳遞更為完整5、采用溫度、藥物或紫外線照射等處理鈍化一方親株的原生質體，然后再與另一親株的原生質體融合，可去除一方親株，提高篩選效率6、與其他育種方法結合，提高篩選效率（二）原生質體融合的主要驟標記菌株的篩選原生質體的制備原生質體再生試驗原生質體的融合篩選穩(wěn)定的融合子優(yōu)良菌株的篩選

1、標記菌株的篩選

選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株

為了能明確檢測到融合子，參與融合的親株一般都需要帶有可以識別的遺傳標記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性、菌落特征、細胞形態(tài)等.

抗青霉素，菌落小對青霉素敏感，菌落大抗青霉素菌落大

革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖組成溶菌酶微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌革蘭氏陰性菌不能直接溶壁，只有當乙二胺四乙酸（EDTA）存在時，某些革蘭氏陰性菌的細胞壁才能夠被溶菌酶溶解。2、原生質體制備

放線菌的細胞壁結構類似于革蘭氏陽性菌也可采用溶菌酶真菌細胞壁主要由纖維素、幾丁質和葡聚糖等組成青霉菌多用纖維素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等酵母菌細胞壁中的葡聚糖和幾丁質蝸牛酶菌體的前處理在菌體生理狀態(tài)酶的濃度菌齡：對數(shù)生長中期細胞的細胞壁中肽聚糖含量很低，對溶菌酶敏感。酶解溫度影響原生質體制備的因素酶解時間滲透壓細菌中加入EDTA,甘氨酸、青霉素等，放線菌加入甘氨酸，可直接影響細胞壁正常合成以原生質體形成率和再生率之積達到最大的酶濃度為最適酶濃度。常用酶解范圍為20~40℃，具體情況具體分析通過實驗選擇適宜酶解時間保持穩(wěn)定的等滲透壓至關重要，可采用滲透壓穩(wěn)定劑：細菌用蔗糖、氯化鈉；霉菌用氯化鉀、氯化鈉等。原生質體形成率=破壁前菌數(shù)-低滲處理后剩余菌數(shù)破壁前菌數(shù)×100%3.原生質體再生試驗使原生質體重新長出細胞壁，恢復完整的細胞形態(tài)結構酶解除去細胞壁后的原生質體應具有再生能力，即能重新長成胞壁，恢復細胞形態(tài)，并能正常生長繁殖，這是原生質體融合的必要條件.原生質體再生率=再生平板計數(shù)—低滲剩余菌數(shù)破壁前菌數(shù)—低滲剩余菌數(shù)×100%再生率

細菌為3-10%真菌在20-80%不同微生物的原生質體的最適再生條件不同，最重要的一個共同點是都需要高滲透壓4.原生質體融合聚乙二醇（PEG）能有效地促進原生質體融合一般PEG的使用濃度范圍在25-60%采用電融合儀：在高頻電場下，用直流電穿孔來進行融合影響原生質體融合的因素有：促融劑的濃度、作用時間、陽離子濃度和pH等。當然更重要的是親株本身特性的選擇，以及盡可能制備具有活力的原生質體。

微生物原生質體融合的一般原理和過程

原生質體經(jīng)過融合得到的融合細胞出現(xiàn)兩種情況，一種是真正的融合，產(chǎn)生雜合二倍體(融合后的二倍體細胞分裂而不分離，分裂后的細胞仍保持二倍體狀態(tài))或單倍重組體；第二種情況是暫時的融合，形成異核體。5．融合子的選擇一融合子的遺傳分析

重組子的檢出方法有兩種：直接法將融合液涂布在補充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。6.優(yōu)良菌株的篩選

通過兩親株遺傳標記的互補而得以識別兩親株的遺傳標記分別為營養(yǎng)缺陷型A+B-和A-B+，融合重組子應是A+B+或A-B-

。六、基因工程技術基因工程是現(xiàn)代生物工程技術的重要組成部分?；蚬こ逃址Q為遺傳工程、DNA重組技術、基因克隆。基因工程的出現(xiàn)使遺傳學實現(xiàn)了一個巨大的飛躍，使遺傳學及育種研究可以按照人們的愿望有計劃地實施和控制。六、基因工程技術1、含目的基因DNA片斷的制備。2、選擇合適的載體。3、帶有目的基因的DNA片斷與載體連接。4、將重組的DNA分子導入受體細胞，

在受體細胞內擴增。5、篩選和鑒定出帶有重組DNA的轉化細胞。6、表達、鑒定外源基因的表達產(chǎn)物。

體外重組DNA技術基因重組轉化4.基因工程

回本章目錄（二）DNA重組的操作1、含目的基因DNA片斷的制備(1）限制性內切酶(2)目的基因DNA片段的獲得

由兩個主要途徑獲得：一是從具有此基因片段的生物體染色體中分離二是根據(jù)已知的氨基酸順序或已有的互補RNA進行合成。

2、基因工程常用的載體

載體是指在克隆其他DNA片斷時使用的運載體，與外源DNA片段連接后也能在受體細胞中復制。(1)載體的種類：用于基因工程的載體有三類：質粒載體；噬菌體載體；根據(jù)特殊要求構建的載體

(2)質粒的制備質粒制備分三步進行：細菌培養(yǎng)和質粒擴增；細菌細胞收集和裂解；質粒DNA提取。1）

質粒（plasmid）

質粒是能自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，在細菌中獨立于染色體之外而存在，存在普遍，幾乎所有細菌株系都含有質粒。高拷貝數(shù)質粒：質粒在宿主中有10~100個拷貝低拷貝數(shù)質粒:質粒在宿主中只有1~4個拷貝

質粒的特點1）

質粒（plasmid）

質粒的特點質粒回本章目錄基因工程對質粒的要求構建一種質粒載體,對質粒通常有以下幾個方面的要求:①質粒載體的相對分子質量應盡可能小。實驗證明，質粒大于15kb時，其將外源DNA轉入大腸桿菌的幾率就會大大降低；②在宿主細胞中能自主復制和穩(wěn)定地遺傳③應該有用來克隆外源DNA的單一的限制性內切酶識別位點④具有明顯的篩選標記⑤能轉化比較廣的宿主細胞3．目的基因與載體的連接得到目的基因與載體后，把它們相互連接即進行體外人工重組，其連接有4種方式。

(1)黏性末端連接(2)平頭連接(平齊末端連接)

(3)同聚末端連接——加接頭(4)人工接頭(人工黏性末端)4．重組DNA引入宿主細胞重組DNA只有進入受體細胞才能進一步實現(xiàn)擴增和表達。

5．重組體的篩選和表達產(chǎn)物的鑒定(1)重組體的篩選(2)表達產(chǎn)物的鑒定（三）微生物基因工程的應用1、常規(guī)發(fā)酵工業(yè)

可通過基因工程獲得工程菌。2、提高菌種產(chǎn)量3、生產(chǎn)重要藥物中間體的工程菌4、基因工程藥物開發(fā)5、環(huán)保、生物固氮等。第二節(jié)菌種保藏與復壯菌種保藏：(1)目的：

①存活，不丟失，不污染②防止優(yōu)良性狀喪失

③隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種

(2)原理：選用優(yōu)良的純種，（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等），創(chuàng)造降低微生物代謝活動強度，生長繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件。（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑等）

二.菌種的復壯rejuvenation

狹義復壯

在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達到恢復原菌株固有性狀的相應措施；廣義復壯

在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種，也稱生產(chǎn)育種。菌種的復壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復原來優(yōu)良性狀。菌種的復壯措施：

①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細胞挑取法等）。

②通過寄主體內生長進行復壯（如Bt、白僵菌、多角體病毒等的復壯）；

③淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。

④采用有效的菌種保藏方法。（1）劃線法：簡單、快捷。（2）稀釋法：菌落單一均勻。

純種分離方法一、固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法接種針先以火焰滅菌法滅菌

步驟一輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻

步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細菌。

步驟三更換一個新的無菌營養(yǎng)平板

步驟四將接種針上的細菌劃于一個新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。步驟五重復第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。步驟七重復第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。

步驟八重復第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九

在營養(yǎng)平板上貼好標簽，標示好接種日期、操作者姓名、菌種學名以及培養(yǎng)基名稱。步驟十固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法需要使用的儀器——震蕩機

吸取準備好欲稀釋的菌液取含有9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時試管須做記號為第一次稀釋。將試管于震蕩機上，使菌液混合均勻取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL，加入另一個新的含9mL無菌水的試管中。重復此步驟直至所需要的稀釋濃度。

從最后稀釋菌液中吸取0.1mL菌液，置入準備好的無菌瓊脂內。將三角玻璃棒浸于酒精中

將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）

使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。

4.生產(chǎn)性能的測定

一般采用兩步法：

初篩：以量為主

復篩：以質為主菌種保藏機構的任務：廣泛收集科研和生產(chǎn)菌種、菌株，并加以妥善保管，使之達到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。菌種保藏機構：

中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM)

美國的典型菌種保藏中心(ATCC)

英國國家典