基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)N-糖基化定性與定量新技術(shù)

基于生物質(zhì)的蛋白質(zhì)N-糖基定性與定新技術(shù)本論文研究內(nèi)容涉及分析化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)等二級(jí)學(xué)科屬交叉學(xué)科研究領(lǐng)域。主要在生物質(zhì)譜技術(shù)的基礎(chǔ)上,發(fā)展針對(duì)蛋白質(zhì)型糖基化修飾定性與定量研究的創(chuàng)新性技術(shù)與方法,以準(zhǔn)確高效地揭示蛋白質(zhì)糖基化修飾的多方面信息,包括糖蛋白／糖肽、糖基化位點(diǎn)、糖鏈等。糖基化修飾是生命活動(dòng)中最廣泛最復(fù)雜也是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,不僅影響著蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運(yùn)輸和定位,且在分子識(shí)別、細(xì)胞通信信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等特定生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用糖蛋白根據(jù)其糖鏈結(jié)構(gòu)及糖基化位點(diǎn)的不同可分為三大類蛋白糖蛋白和GPI錨定蛋白,其中又以N-糖蛋白分布最為廣泛。據(jù)推斷,有超過的蛋白質(zhì)都發(fā)生了糖基化修飾,但是現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中只有約10%的蛋白質(zhì)被注釋為糖蛋白,說明絕大多數(shù)糖蛋白尚未被發(fā)現(xiàn)。糖基化研究仍處于起步階段,缺乏高效的、成熟的技術(shù)手段。在后基因組時(shí)代,基于對(duì)蛋白質(zhì)高通量統(tǒng)性研究的蛋白質(zhì)組學(xué)迅速興起。而以軟電離為基礎(chǔ)的生物質(zhì)譜技術(shù)為蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展提供了有力工具。近年來,生物質(zhì)譜技術(shù)同樣被應(yīng)用于糖基化修飾的研究主要包括糖基化位點(diǎn)的鑒定和糖鏈結(jié)構(gòu)的解析等方面,而針對(duì)糖蛋白糖鏈進(jìn)行大規(guī)模研究的糖蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)也隨之應(yīng)運(yùn)而生而,糖鏈屬非模板合成其結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜且呈二維結(jié)構(gòu),同時(shí)糖鏈離子化效率低分異構(gòu)體多在質(zhì)譜分析上仍存在諸多技術(shù)瓶頸?？梢?糖基化領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展亟待方法學(xué)上的新突破。本論文以生物質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ),從定性研究和定量研究兩方面,展了針對(duì)蛋白質(zhì)N-糖基化修飾研究的新技術(shù)與新方法,致力于建立高效用的糖基化解析策略解決當(dāng)今糖蛋白質(zhì)組學(xué)與糖組學(xué)所面臨的技術(shù)難題。本論文工作的主要貢獻(xiàn)如下：成功將糖苷內(nèi)切酶(Endo)應(yīng)用于大規(guī)模、高通量的N-糖基化位點(diǎn)質(zhì)譜鑒定,與傳統(tǒng)的肽糖酰胺酶(PNGase)形成互補(bǔ)并利用這兩種酶切路線,從大鼠肝臟組織中鑒定到大量尚未被發(fā)現(xiàn)或證實(shí)的N-糖基化位點(diǎn)(2)首次發(fā)現(xiàn)酶促N-糖18O標(biāo)記反應(yīng),并基于此反應(yīng)發(fā)展了酶促糖鏈還原末18O標(biāo)GREOL技術(shù),有效用于糖鏈的質(zhì)譜相對(duì)定量,彌補(bǔ)了定量糖組學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)技術(shù)空白(3)通過條件優(yōu)化,首次實(shí)現(xiàn)了酶促N-糖鏈的完18O標(biāo)記并基于此反應(yīng)創(chuàng)新性地發(fā)展了酶18O4標(biāo)記技術(shù),成功用于糖鏈、糖肽非糖肽的一步定量分析,在一次實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)糖基化的全方位定量解析發(fā)展了硼氫化鈉輔助的酶促N-糖鏈18O技術(shù)與18O+D雙標(biāo)記技術(shù),不僅大大增加了酶促糖鏈18O標(biāo)記的穩(wěn)定性更通過雙標(biāo)記使糖鏈質(zhì)量差異增加到3Da,大大降低了同位素峰重疊效應(yīng)的影響針對(duì)上述幾點(diǎn)本論文分別從以下幾方面進(jìn)行了闡述：基于糖苷內(nèi)切酶(Endo)肽N-糖酰胺酶(PNGase)互補(bǔ)的大規(guī)模N-糖基化位點(diǎn)鑒定：蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)的大規(guī)模鑒定是糖蛋白質(zhì)組學(xué)定性研究的重要內(nèi)容。PNGaseF是目前普遍使用的鑒定糖基化位點(diǎn)的酶,該酶會(huì)使糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺去氨基化并發(fā)生+0.98Da的質(zhì)量變化以此作為標(biāo)簽,即可質(zhì)譜鑒定糖基化位點(diǎn)然而,高通量高效率的質(zhì)譜分析難以兼顧靈敏度與分辨率這使得0.98Da質(zhì)量差異的精確分辨在大規(guī)模的分析中難以得到保證。同時(shí),天冬酰胺與天冬氨酸之間自然相互轉(zhuǎn)換也時(shí)有發(fā)生影響了糖基化位點(diǎn)鑒定的可信度。與PNGaseF不同,Endo酶切糖鏈后在糖基化位點(diǎn)上保留最后一個(gè)GlcNAc,形成203Da質(zhì)量差異,以此為標(biāo)簽鑒定的準(zhǔn)確性大大提高。然而,目前Endo尚被應(yīng)用于大規(guī)模的糖基化位點(diǎn)鑒定。本論文將EndoH與傳統(tǒng)PNGase結(jié)合對(duì)大鼠肝臟組織的高甘露糖型和雜合型N-糖基化進(jìn)行大規(guī)模位點(diǎn)鑒定,成功將EndoH應(yīng)用于高通量、大規(guī)模的糖基化位點(diǎn)鑒定。利用凝集素ConA親和富集、兩種切糖酶酶切、檢測(cè)分析的路線,共從大鼠肝臟組織中鑒定到1063非冗余的高甘露糖型與雜合型糖基化位點(diǎn)及相應(yīng)560個(gè)非冗余的N-糖蛋白,其中大部分糖基化位點(diǎn)為首次發(fā)現(xiàn)為大鼠蛋白數(shù)據(jù)庫提供了大量新的糖基化修飾信息。該部分的研究意義與創(chuàng)新性如下：(1)首次將Endo用于大規(guī)模的N-糖基化位點(diǎn)鑒定證明了Endo應(yīng)用于高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的可行性；(2)將PNGaseF與EndoH兩種酶切技術(shù)路線獲得的結(jié)果相結(jié)合,得到了更大的N-糖基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)集其中包括大量尚未在大鼠中發(fā)現(xiàn)的N-糖基化位點(diǎn)與N-糖蛋白,顯示了兩種酶的非交蓋性與互補(bǔ)性(3)Endo酶切方法不僅提供了糖基化位點(diǎn)的糖鏈亞型結(jié)構(gòu)還提供了糖基化位點(diǎn)的核心巖藻糖信息,對(duì)糖基化位點(diǎn)特異性與不均一性研究、核心巖藻糖化糖蛋白研究都具有重要意義；(4)對(duì)Endo與PNGase兩類酶在位點(diǎn)鑒定中的不同優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)進(jìn)行了深入分析與討論,簡而言之,PNGase可以獲得更多的鑒定結(jié)果,而Endo獲得的結(jié)果可信度更高；(5)分析了Endo酶切方法存在的問題與不足,為進(jìn)一步的深入優(yōu)化與改進(jìn)提供了方向。糖苷內(nèi)切酶(Endo)催化N-糖鏈18O標(biāo)記及其在定量糖組學(xué)中的應(yīng)用：隨著糖蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,針對(duì)蛋白質(zhì)糖基化修飾的相對(duì)定量研究受到越來越多的關(guān)注,對(duì)探索生理病理過程中糖基化修飾的變化、尋找潛在的疾病標(biāo)志物具有重要意義。高通量的糖鏈定量即定量糖組學(xué),致力于研究不同生理病理?xiàng)l件下的復(fù)雜樣本中糖鏈在結(jié)構(gòu)類型、組成以及連接、構(gòu)象精細(xì)結(jié)構(gòu)上的相對(duì)量的變化。與定量蛋白質(zhì)組學(xué)類似,基于質(zhì)譜的穩(wěn)定同位素標(biāo)記也是定量糖組學(xué)研究的有效手段和發(fā)展方向,目前建立的標(biāo)記技術(shù)包括還原末端標(biāo)記、全甲基化標(biāo)記和代謝標(biāo)記。酶促18O標(biāo)記是定量蛋白質(zhì)組學(xué)中一項(xiàng)重要的標(biāo)記定量技術(shù)。酶促’8O標(biāo)記的最大優(yōu)勢(shì)在于其成本低廉、操作簡單、標(biāo)記效率,因?yàn)闃?biāo)記反應(yīng)在酶解過程中進(jìn)行,除H218O外,不涉及任何額外的反應(yīng)試劑,沒有額外的反應(yīng)步驟,也不會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)而,酶促18O標(biāo)記在定量糖組學(xué)領(lǐng)域仍是一項(xiàng)空白。而在使用Endo進(jìn)行進(jìn)一步的研究工作時(shí)我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)在H218O中進(jìn)行Endo酶切時(shí),釋放的N-糖鏈還原末端會(huì)被穩(wěn)定地標(biāo)記上一個(gè)原子?；诖朔磻?yīng)本論文發(fā)展了酶促糖鏈還原末端18O標(biāo)記GREOL(glycanreducing-end18Olabeling)技術(shù),并創(chuàng)新性地建立了酶促糖鏈同位素標(biāo)記定量策略。Endo酶促反應(yīng)使所有酶切釋放N-糖鏈都可以穩(wěn)定地標(biāo)記上一個(gè)原子,且適用于所有Endo亞型基于該反應(yīng)的GREOL術(shù)經(jīng)質(zhì)譜分析與去卷積修正后,在至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)顯示出良好的線性與重復(fù)性及較高的檢測(cè)靈敏度,可有效應(yīng)用于定量糖組學(xué)。利用該技術(shù)的特點(diǎn),我們還實(shí)現(xiàn)了一些分子量相同而結(jié)構(gòu)類型不同的N-糖鏈同分異構(gòu)體之間的定量分辨了進(jìn)一步證明GREOL對(duì)定量在復(fù)雜生物樣品中的可靠性,我們還將該技術(shù)應(yīng)用于肝細(xì)胞肝癌相關(guān)定量血清糖組學(xué)研究。該部分的研究意義與創(chuàng)新性如下：首次發(fā)現(xiàn)在H218O反應(yīng)體系中Endo在酶切釋放N-糖鏈的同時(shí),穩(wěn)定地在N-糖鏈還原末端引入一個(gè)18O原子,標(biāo)記效率為100%(2)基于該反應(yīng)建立了酶促同位素18O標(biāo)記定量的GREOL技術(shù),首次將酶促同位素標(biāo)記應(yīng)用于糖鏈的質(zhì)譜相對(duì)定量彌補(bǔ)了定量糖組學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)空白；(3)深入探討了Endo酶促18O標(biāo)記的反應(yīng)機(jī)理并建立了針對(duì)該標(biāo)記的質(zhì)譜數(shù)據(jù)去卷積修正方法,最大程度地避免同位素峰重疊造成的影響,使GREOL定量展示出良好的線性、重復(fù)性和靈敏度；(4)利用技術(shù),首次實(shí)現(xiàn)了一些糖鏈同分異構(gòu)體的定量分辨,使相對(duì)定量不再局限于相同結(jié)構(gòu)的糖鏈之間,為定量糖組學(xué)研究提供了嶄新的視角用GREOL技術(shù),發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞肝癌相關(guān)的血清N-糖鏈中,雙鏈復(fù)雜型糖鏈、平分型GlcNAc構(gòu)水平、唾液酸水平均呈上調(diào)趨勢(shì),提示肝癌的發(fā)生發(fā)展同這些結(jié)構(gòu)的定量改變關(guān)系密切為進(jìn)一步的功能研究找潛在的診斷標(biāo)志物奠了基礎(chǔ)N-酰胺酶(PNGase)催化的一步標(biāo)記及其在蛋白質(zhì)N-糖基化定量研究中的應(yīng)用與相比,傳統(tǒng)酶切的是糖鏈末端與糖基化位點(diǎn)間的酰胺鍵,其反應(yīng)機(jī)制與糖苷酶完全不同。PNGase首先特異性識(shí)別并水解糖鏈還原末GlcNAc與位點(diǎn)Asn之間羰基與氨基形成的共價(jià)鍵,將Asn水解為Asp后,末端為氨基的糖鏈部分糖胺)釋放,再在溶液中進(jìn)一步水解去氨基化,形成末端為羥基的糖鏈于在糖基化修飾研究領(lǐng)域的應(yīng)用更為廣泛,我們?cè)鴩L試催化糖鏈記的可能性。但研究結(jié)果表明,由于去氨基化反應(yīng)本身是可逆的,即使溶液不含氨,糖胺水解后產(chǎn)生的氨仍會(huì)在一定程度上阻止去氨基化的完全發(fā)生溶液中仍會(huì)保留大量糖胺。剩余的糖胺在之后的純化過程當(dāng)中發(fā)生進(jìn)一步水解而純化過程中大量使用的普通H216O會(huì)使這部分糖鏈帶上16O,造成相當(dāng)數(shù)量的糖鏈被標(biāo)記為16O,無法用于相對(duì)定量。本論文通過進(jìn)一步改PNGase酶切后溶液值,發(fā)現(xiàn)在酸性條件下,糖胺去氨基化可以完全發(fā)生,徹底轉(zhuǎn)變?yōu)槟┒藶榱u基的糖鏈。基于此現(xiàn)象我們?cè)贖218O配置的緩沖溶液中進(jìn)行PNGase酶切并將酶切后溶液的pH調(diào)至酸性最終實(shí)現(xiàn)了PNGase催化下N-糖鏈的完全18O標(biāo)記。在經(jīng)質(zhì)譜分析及去卷積修正后該方法在兩個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)同樣表現(xiàn)出良好的線性與重復(fù)性?；诖?我們進(jìn)一步將PNGasr酶促糖鏈18O標(biāo)記、位點(diǎn)標(biāo)記和trypsin酶促肽18O2標(biāo)記結(jié)合,創(chuàng)造性地發(fā)展了18O4記,一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)實(shí)現(xiàn)糖鏈、糖基化位點(diǎn)和糖肽的相對(duì)定量。我們將該技術(shù)應(yīng)用于肝細(xì)胞肝癌相關(guān)血清蛋白的糖基化定量研究,發(fā)現(xiàn)了與肝癌相關(guān)的IgG糖肽、糖基化位點(diǎn)和N-鏈的定量改變。18O4標(biāo)記策略實(shí)現(xiàn)了糖蛋白質(zhì)組學(xué)與糖組學(xué)的一步定,極大地促進(jìn)了這兩個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展與融合。該部分的研究意義與創(chuàng)新性如下：通過使糖胺徹底水解,首次實(shí)現(xiàn)了PNGase酶促N-糖鏈還原末端180標(biāo)記反應(yīng),記效率幾乎為100%(2)考察了該標(biāo)記技術(shù)用于糖鏈相對(duì)定量的準(zhǔn)確性、線性、重復(fù)性并探討了該技術(shù)與的互補(bǔ)性；(3)建立了酶促1804標(biāo)記定量技術(shù)實(shí)現(xiàn)一步到位的糖鏈18O標(biāo)記、糖基化位點(diǎn)18O標(biāo)記和肽段18O2標(biāo)記,用于糖鏈、糖肽糖基化位點(diǎn)、非糖肽/蛋白的同時(shí)定量用18O4標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞肝癌相關(guān)血清進(jìn)行了N-糖基化定量研究,并發(fā)現(xiàn)糖肽與糖蛋白水平并未發(fā)生明顯變化,而糖鏈卻呈現(xiàn)諸多改變,其中雙鏈和含平分型GlcNAc的糖鏈明顯增多而單鏈的糖鏈明顯減少,說明蛋白部分與糖鏈部分的定量改變并不一致這為進(jìn)一步的研究和潛在診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。硼氫化鈉輔助的酶促糖鏈18O標(biāo)記技術(shù)與雙同位素標(biāo)記技術(shù)：本論文發(fā)展了兩種酶促糖鏈18O記技術(shù),但這些反應(yīng)僅能在糖鏈上標(biāo)記一18O原子形成較小2Da子量差異,在質(zhì)譜分析中易造成較為嚴(yán)重的同位素峰重疊現(xiàn)象。雖然該現(xiàn)象可以通過去卷積修正計(jì)算最大限度地避免但這還是增加了定量分析的工作量,并且兩組樣品需先分別檢測(cè)后才能混合檢測(cè),由此造成的操作誤差也會(huì)比較大。除此之外,標(biāo)記后糖鏈上的仍會(huì)同普通水中的16O發(fā)生緩慢交換,造成長時(shí)間在普通水中儲(chǔ)存的標(biāo)記糖鏈摻入大量的標(biāo)記,使定量效果大大折扣。為了解決上述問題,本論文進(jìn)一步發(fā)展了硼氫化鈉輔助的酶促18O標(biāo)記技術(shù)與’8O+D雙標(biāo)記技術(shù),即在酶促糖鏈18O標(biāo)記反應(yīng)完成后向反應(yīng)體系中加入氘代硼氫化鈉,使糖鏈還原末端發(fā)生還原,半縮醛斷開氫形成糖醇結(jié)構(gòu),并標(biāo)記上一個(gè)氘原子。而還原后的糖鏈不再含有還原末端也不會(huì)再同溶液中的氧原子發(fā)生任何交換,使18O標(biāo)記更加穩(wěn)定。同時(shí),標(biāo)記的氘原子使兩組樣品的分子量差異擴(kuò)大到大大降低了同位素峰的重疊程度,使糖鏈酶促定量分析更加簡單、可靠。我們通過實(shí)驗(yàn)考查了該方法的標(biāo)記穩(wěn)定性與同位素峰重疊性,均取得了很好的效果。通過氘代硼氫化鈉的輔助標(biāo)記我們改進(jìn)了N-糖鏈的酶促18O標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)了該技術(shù)在定量糖組學(xué)中的廣泛應(yīng)