第四章 (一) 色譜法概述

第四章

（一）色譜法概述一、概述俄國植物學家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如右圖。混合物樣品在色譜柱中的分離情況☆色譜法是一種分離技術(shù)；☆試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程?！钇渲械囊幌喙潭ú粍樱Q為固定相；☆另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。從不同角度，可將色譜法分類如下：色譜法分類二、色譜流出曲線及其有關(guān)術(shù)語由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線（見右圖）。曲線上突起部分就是色譜峰。如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則色譜峰是對稱的，可用Gauss正態(tài)分布函數(shù)表示:C:不同時間t時某物質(zhì)的濃度；C0:進樣濃度；tr:對應(yīng)于濃度峰值的保留時間；σ:標準偏差。1.基線：無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2.保留值(1)時間表示的保留值:保留時間（tR）：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間。(2)死時間(tM):

不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時間。(3)調(diào)整保留時間(tR’):

tR＇=tR-tM

續(xù)（2）用體積表示的保留值保留體積（VR）：VR=tR×F0F0為洗脫液流速。單位：mL/min。死體積（VM）：

VM=tM×F0調(diào)整保留體積（VR＇）：

V

R＇=VR

－VM

續(xù)(3)相對保留值r2,1某組分2

的調(diào)整保留值與組分1

的調(diào)整保留值之比．稱為相對保留值。由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與栓徑、柱長、填充情況及流動相流速無關(guān)。因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。3.區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。(1)標準偏差σ：即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。

(2)半峰寬Y1/2：即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標準偏差的關(guān)系為:Y1/2＝2.354σ.(3)峰底寬度Y：即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標準偏差σ的關(guān)系是：Y=4σ

從色譜流出曲線中，可得許多重要信息。從色譜流出曲線中可得信息:(i)根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)；(ii)根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；(iii)據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；(iv)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)；(v)色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(或流動相)選擇是否合適的依據(jù)。三、色譜法基本原理

色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊、還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學和動力學兩方面來研究色譜行為。下圖是A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓。圖中KA＞KB，因此A組分在移動過程中滯后。隨著兩組分在色譜柱中移動距離的增加，兩峰間的距離逐漸變大，同時每一組分的濃度輪廓(即區(qū)域?qū)挾?也慢慢變寬。顯然，區(qū)域擴寬對分離是不利的、但又是不可避免的。若要使A、B兩組分完全分離，必須滿足以下三點：續(xù)第一，兩組分的分配系數(shù)（即與固定相的結(jié)合能力）必須有差異；第二，區(qū)域擴寬的速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速度；第三，在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。前兩點是完成分離的必要條件。1.分配系數(shù)和分配比（1）分配系數(shù)K

分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復多次地分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復多次地吸附—脫附過程。這種分離過程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)K。它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動向之間分配達到平衡時的濃度之比值，即分配系數(shù)K的討論(a)

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；(b)試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；(c)

每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；(d)

選擇適宜的固定相可改善分離效果；(e)

試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。

分配系數(shù)是由組分和固定相和流動相的熱力學性質(zhì)決定的，它是每一個溶質(zhì)的特征值。它僅與固定相和流動相的性質(zhì)及溫度有關(guān)

。與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無關(guān)。分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時固定相和流動相中的質(zhì)量比。即（2）分配比kk值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關(guān)。續(xù)可以證明：k是組分的調(diào)整保留時間與死時間之比。即:式中Cs，Cm分別為組分在固定相和流動相的濃度；Vm為柱中流動相的體積，近似等于死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。k=tr/tm2.塔板理論色譜柱長：L；虛擬的塔板間距離：H；色譜柱的理論塔板數(shù)：n；則三者的關(guān)系為：n=L/H（1）理論假定把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標。該理論假定：(i)

在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱稱為理論塔板高度H。(ii)

流動相進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積(ΔVm)。(iii)所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸(縱)向擴散可忽略。(iv)

分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)。與組分在某一塔板上的量無關(guān)。續(xù)n=L/Hn稱為理論塔板數(shù)。色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。對一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：（2）塔板分離示意為簡單起見，(a)設(shè)色譜柱由5塊塔板(n=5,n為為柱子的塔板數(shù))組成，編號，分別為0，1，2，...，n-1。(b)某組分的分配比k=1.該組分的分布可計算如下：續(xù)（1）開始時，若有單位質(zhì)量，即m=1(1mg或1ug)的該組分加到第0號塔板上，分配達平衡后，由于k=1，即p=q,故p=q=0.5.（2）當一個板體積(1ΔV)的淋洗液以脈動形式進入0號板時，就將流動相中含有q部分組分的淋洗液頂?shù)巾數(shù)?號板上，此時0號板液相中p部分組分及1號板流動相中的q部分組分，將各自在兩相間重新分配，故0號板上所含組分總量為0.5，其中流動相和固定相兩相各為0.25；而1號板上所含總量同樣為0.5，流動相和固定相兩相亦各為0.25。以后每當一個新的板體積流動相以脈動式進入色譜住時，上述過程就重復一次，如上圖所示。（3）塔板理論結(jié)論第一當溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n大于50時，可得到基本對稱的峰形曲線。在色譜柱中，n值—般是很大的，如氣相色譜柱的n約為103-106。因而這時的流出曲線可趨近于正態(tài)分布曲線。第二當試樣進入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離。第三

n與半峰寬度及峰底寬的關(guān)系式為：式中tR與Y1/2(或Y)應(yīng)采用同一單位(時間或距離).可以看出，在tR一定時，如果色譜峰越窄，則說明n越大，H越小．柱效能越高。續(xù)在實際工作中，常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效：因為在相同的條件下，對不同的物質(zhì)計算所得的塔板數(shù)不一樣，因此，在說明柱效時，除色譜條件外，還應(yīng)指出是用什么物質(zhì)來進行測量的。（4）例題（理論塔板數(shù)的計算）已知某組分峰的峰底寬40s，保留時間為400s，計算此色譜柱的理論塔板數(shù)。解：3.速率理論-影響柱效的因素1956年荷蘭學者范.弟姆特（VanDeemter）等在研究氣液流色譜時，提出了色譜過程動力學理論—速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，從而在動力學基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用，VanDeemter方程的數(shù)學簡化式為：續(xù)式中H：理論塔板高度，u為流動相的線速度；A，B,C為常數(shù)，分別代表了渦流擴散項系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質(zhì)阻力項系數(shù)。（1）改變A、B、C三項可提高柱效；（2）存在著最佳流速；（3）A、B、C三項各與哪些因素有關(guān)？（1）渦流擴散項A

在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴散。

由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一，因而同時進色譜柱的相同組分到達柱口時間并不一致，引起了色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定：續(xù)A=2λdpLA與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細管，不存在渦流擴散。因此A＝0。(2)分子擴散項B／u(縱向擴散項)

縱向分子擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。如右圖所示。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴散，造成譜帶展寬。分子擴散項系數(shù)為：B＝2γDg

(a)柱內(nèi)譜帶構(gòu)型；(b)相應(yīng)的響應(yīng)信號。式中γ是填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素,也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況,填充柱色譜,γ<1。Dg為組分在流動相中擴散系數(shù)(cm2·s-1)。續(xù)Dg與流動相及組分性質(zhì)有關(guān)（柱溫；柱壓等）：(a)

擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(b)

分子擴散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴散↑;(c)

擴散系數(shù)：Dg∝（M載氣）-1/2；M載氣↑，B值↓。對于液相色譜，組分在流動相中縱向擴散可以忽略。(3)傳質(zhì)阻力項C·u傳質(zhì)：物質(zhì)系統(tǒng)由于濃度不均勻而發(fā)生物質(zhì)遷移的過程。影響這個過程進行速度的阻力，叫傳質(zhì)阻力。C=（Cg+CL）傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL，液相相傳質(zhì)阻力大于氣相傳質(zhì)阻力。即：

續(xù)(a)

對于氣液色譜。傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程。傳質(zhì)過程中試樣組分將在兩相間進行質(zhì)量交換，即進行濃度分配。有的分子還來不及進入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進入兩相界面又來不及返回氣相。這樣，使得試樣在兩相界面上不能瞬間達到分配平衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。(b)

對于液液分配色譜，傳質(zhì)阻力系數(shù)(C)包含流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)(Cm)和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cs），即：

C=Cm+Cs（4）流動相線速度對板高的影響(a)LC的H—u圖對于—定長度的柱子，柱效越高，理論塔板數(shù)越大，板高越小。但究競控制怎樣的線速度，才能達到最小板高呢?根據(jù)vanDeemter公式作LC的H～u圖.不難看出：對應(yīng)某一流速都有一個板高的極小值，這個極小值就是柱效最高點.(b)分子擴散項和傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻

較低線速時，分子擴散項起主要作用；較高線速時，傳質(zhì)阻力項起主要作用；其中流動相傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻兒乎是一個定值。在高線速度時，固定相傳質(zhì)阻力項成為影響板高的主要因素．隨著速度增高板高值越來越大，柱效急劇下降。1.H—u關(guān)系曲線2.固定相傳質(zhì)阻力項(Cgu)3.流動相傳質(zhì)阻力項(Cmu)4.分子擴散項(B／u)分子擴散和傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻(c)固定相粒度大小對板高的影晌

固定相粒度對板高的影響是至關(guān)重要的。實驗表明不同粒度，H-u曲線也不同.粒度越細，板高越小，并且受線速度影響亦小。這就是為什么在HPLC中采用細顆粒作固定相的根據(jù)。當然．固定相顆粒愈細，柱流速愈慢。只有采取高壓技術(shù)，流動相流速才能符合實驗要求。粒度尺寸對板高的影響

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：

保留值之差──色譜過程的熱力學因素；區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動力學因素。

4.分離度色譜分離中的四種情況如圖所示：續(xù)①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大,分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。分離度：定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差，與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即續(xù)(a)兩色譜蜂距離近并且峰形寬，兩峰嚴重相疊，這表示選擇性和柱效都很差。(b)雖然兩峰距離拉開了，但峰形仍很寬，說明選擇性好，但柱效低。(c)分離最理想，說明選擇性好，柱效也高。R<1時，兩峰總有部分重疊；R=1時，兩峰能明顯分離；R=1.5時，兩峰已完全分離。R=0.8：兩峰的分離程度可達89%；R=1.0：分離程度98%；R=1.5：達99.7%（相鄰兩峰完全分離的標準）。四、應(yīng)用1.定性分析(1)利用純物質(zhì)定性的方法

利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。

利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。(2)利用文獻保留值定性相對保留值r21：相對保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進行定性鑒定。（3）保留指數(shù)又稱Kovats指數(shù)（Ⅰ），是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測定方法：將正構(gòu)烷烴作為標準，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過選定兩個相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z＋1個碳原子。被測物質(zhì)X的調(diào)整保留時間應(yīng)在相鄰兩個正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：保留指數(shù)計算方法2.色譜定量分析方法(1)絕對校正因子在一定的色譜條件下，組分i的質(zhì)量（mi）或其在流動向中的濃度，與檢測器響應(yīng)信號（峰面積Ai或峰高hi）呈正比：或mi=fiAAi

mi=fihhi式中fiA和fih是絕對校正因子。上述兩式是色譜定量分析的依據(jù)。絕對校正因子受儀器及操作條件的影響很大，故其應(yīng)用受到限制。在實際定量分析中，一般常采用相對校正因子。相對校正因子f

’i即組分的絕對校正因子與標準物質(zhì)的絕對校正因子之比。當mi、mS以摩爾為單位時，所得相對校正因子稱為相對摩爾校正因子,用（f’M）表示；當mi、mS用質(zhì)量單位時,以（f’W）,表示。由于絕對因子很少使用，因此，一般文獻上提到的校正因子，就是相