wzc高級生化4-蛋白質(zhì)的分離

第六節(jié)

蛋白質(zhì)的分離純化和分析1一、蛋白質(zhì)分離純化的一般程序

（一）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí)，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性。1.機(jī)械破碎法——利用機(jī)械力的剪切作用，使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。2.滲透破碎法

——在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。23.反復(fù)凍融法

生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。該法簡單方便，但對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。4.超聲波法

使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。5.酶法

如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。3(二)蛋白質(zhì)的抽提

通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等應(yīng)根據(jù)性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（SDS、tritonX-100等），使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。4蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。

性質(zhì)方法分子大小——透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度——等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀電荷——電泳、離子交換層析吸附性質(zhì)——吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）特異性結(jié)合——親和層析5蛋白質(zhì)的分離純化方法分子大小透析和超過濾：透析指利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而與小分子分離；超濾是利用壓力或離心力使小分子溶質(zhì)通過半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上而分離。密度梯度離心：蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。凝膠過濾：即分子排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子最先流出層析柱。溶解度等電點(diǎn)沉淀和pH控制鹽溶和鹽析：中性鹽在低濃度時(shí)可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強(qiáng)；當(dāng)離子強(qiáng)度增大到足夠高時(shí)，此時(shí)與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀。有機(jī)溶劑分級分離法：一是降低介質(zhì)的介電常數(shù)，二是與蛋白質(zhì)爭奪水化水。溫度沉淀：溫度對溶解度有影響，低溫穩(wěn)定，高溫不穩(wěn)定。在0-40℃，大部分的球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增加。6蛋白質(zhì)分離純化方法電荷電泳（凈電荷、分子大小、形狀）區(qū)帶電泳聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）毛細(xì)管電泳離子交換層析等電聚焦：外加電場時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH處，形成區(qū)帶。層析聚焦：層析柱中建立連續(xù)的pH梯度，蛋白質(zhì)樣品由柱上端隨緩沖液的展開而聚焦在各自的等電點(diǎn)pH處，形成區(qū)段。吸附：吸附層析，吸附劑（硅石、氧化鋁、活性碳）和疏水吸附劑，與待分離分子和雜質(zhì)分子的吸附與解吸能力不同。特異親和力：親和層析其它：如高效液相層析（HPLC）,快速蛋白液相層析（FPLC）7（三）蛋白質(zhì)粗制品的獲得

選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離。主要根據(jù)蛋白溶解度的差異。1.等電點(diǎn)沉淀法2.鹽析法分步鹽析分離不同蛋白質(zhì)。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。3.有機(jī)溶劑沉淀法如乙醇、丙酮等，它們的介電常數(shù)比水低，能降低球狀蛋白質(zhì)溶解度;有機(jī)溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。有機(jī)溶劑會使蛋白質(zhì)變性，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度。8（四）樣品的進(jìn)一步分離純化用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。9純化方法1.

凝膠過濾法

(GelFiltrationChromatography，GFC)也稱凝膠過濾或分子排阻層析。這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物有效的方法之一。凝膠過濾所用的介質(zhì)一般是:交聯(lián)葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠Sephacryl10（1）葡聚糖凝膠商品名Sephadex它由線形α－1，6－葡聚糖和3-氯-1,2環(huán)氧丙烷以醚鍵相互交聯(lián)而成的化合物。通過控制葡聚糖和交鏈劑的比例及反應(yīng)條件決定其交聯(lián)度的大小，從而得到各種規(guī)格的葡聚糖凝膠。用G表示交聯(lián)度，G越小，交聯(lián)度越大，凝膠中網(wǎng)眼越小，吸水量就越小。11葡聚糖凝膠的外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下放大700倍，可見其表面的網(wǎng)狀皺紋。它帶有大量的羥基，親水性好，因此在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹。由于各種型號的葡聚糖凝的交聯(lián)度(交聯(lián)劑在葡聚糖凝膠中占的百分?jǐn)?shù))不同，致使其在水中的膨脹度(床體積)、吸水量(每克干凝膠在水中充分膨脹所需的水量。但不包括顆粒間所帶的水量)、篩孔的大小和分級范圍有明顯的差異。例如，SephadexG—25比G—100交聯(lián)度大。而影脹度、吸水量和篩孔直徑前者小于后者。另外，前者對球形蛋白分級范圍較窄。即在1000(下限)一5000(上限)之間，而后者范圍較寬，即在4000—150000之間。12表Sephadex1的種類與特性型號分離范圍（分子量）最小溶脹時(shí)（h）20℃～25℃100℃G10＜7001.0±0.13

12~3G15＜15001.5±0.23

12.5~3.5G25＜50002.5±0.23

14~6G501500～200008.0±0.33

19~11G753000～700007.5±0.524

112~15G1004000～15000010.0±1.072

115~20G1505000～80000015.0±1.5

72

120~30G2005000～300000020.0±2.072

130~40）床體積（ml）/干凝膠（mg吸水量（ml/g）13Sephadex的穩(wěn)定性

葡聚糖凝膠在水、鹽、堿、弱酸溶液和有機(jī)溶劑中是穩(wěn)定的，不溶解的，而且很少產(chǎn)生化學(xué)降解。在中性條件下，葡在0．1m01／LHCl溶液中浸泡1—2小時(shí)，甚至在0．02m01／LHCl溶液中浸泡6個(gè)月以上，對分離效果無明顯的影響。但是，當(dāng)暴露于強(qiáng)酸或氧化劑溶液時(shí)，則容易使糖苷鍵水解斷裂，因此，要避免與其接觸。葡聚糖凝膠欲在室溫下長期保存時(shí)，應(yīng)加入適量的防腐劑如氯仿、疊氮化鈉等。不然，微生物將生長。14吸附性：

葡聚糖凝膠系弱酸性物質(zhì)。這是由于其每克干膠中含10—20微克當(dāng)量的羧基基團(tuán)所致。該基團(tuán)能與分離物中電荷基團(tuán)(尤其是堿性蛋白質(zhì))發(fā)生吸附作用。但是，這種吸附作用可以借助提高洗脫液的離子強(qiáng)度得以克服。當(dāng)離子強(qiáng)度大于0.05時(shí)，一般對弱堿性蛋白質(zhì)就無吸附力了。因此進(jìn)行葡聚糖凝膠層析時(shí)，常用含有NaCL的緩沖液作洗脫液。

15新的葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，雖然吸附的數(shù)量較少，但是在制作測定蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，或者分離純化極難得到的物質(zhì)時(shí)，需先用易得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)層析，以便消除其影響。此外，葡聚糖凝膠對芳香族化合物或雜環(huán)化合物以及某些凝集家具有較強(qiáng)的吸附作用，若采用凝膠過濾層析分離它們時(shí)，往往利用的是吸附原理，而不是排阻原理。16（2）瓊脂糖疑膠瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的。在制備過程要盡可能將其中硫酸根和羧基基團(tuán)的瓊脂膠除去，才能得到不帶電荷基團(tuán)的瓊脂糖。瓊脂糖是由D—半乳糖和3、6脫水的L—半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈。這種多糖鏈在100℃左右時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)溫度下降到45℃以下時(shí)，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。17瓊脂糖的商品名稱是因生產(chǎn)廠家不同而異瑞典稱Sepharose美國稱Bio－gelA英國稱Segavac中國的同類產(chǎn)品與瑞典相同。這些瓊脂糖中除Segavac外，都是以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售。18瓊脂糖凝膠對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強(qiáng)的抵抗力；在pH4.4-9.0的緩沖液中穩(wěn)定。室溫保存，其物理穩(wěn)定性超過了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝膠。瓊脂糖凝膠在干燥狀態(tài)下保存時(shí)易破裂，故放在含防腐劑的水溶液中，同時(shí)還要避免劇烈的攪動。脂糖凝膠按其濃度來分有Sepharose2B(2％濃度)、4B和6B(6％)。Sepharose6B的機(jī)械強(qiáng)度大于2B，但是篩孔小于2B.19

Sepharose與1，3—二溴異丙醇在強(qiáng)堿性條件下反應(yīng)后，即生成CL-型交聯(lián)瓊脂糖。這種瓊脂糖的篩孔與同濃度的未交聯(lián)的瓊脂糖相同，但熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性大大提高。CL-型交聯(lián)瓊脂糖可在廣范圍的pH溶液中使用(pH3～13）,即使較強(qiáng)的堿溶液短時(shí)間處理，期性能也不會改變。但在氧化劑存在時(shí)，會有少量的多糖鏈發(fā)生解聚。瓊脂按凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好。20產(chǎn)品名稱規(guī)格特性及應(yīng)用價(jià)格瓊脂糖凝膠FF100ml用于大分子蛋白、超螺旋DNA、病毒純化等生物大分的分離純化。包括這些樣品的除鹽等。分離范圍1x104-41x106￥600瓊脂糖凝膠FF500ml￥200021（3）聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠的商品名稱為Bio—ge1。它是以甲撐雙丙烯胺胺(雙體)作交聯(lián)劑，以過硫酸銨作催化劑，在N、N、N’、N’—四甲基乙二胺(TEMED)加速劑的作用下，將丙烯酰胺(單體)聚合而成的。當(dāng)改變單體濃度時(shí)，就可得到吸水串不同的產(chǎn)物。商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bio—ge1P—2到P—300，其阿拉伯?dāng)?shù)字相當(dāng)于排阻限度的10—2。22一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式出售，使用前必須溶脹。該凝膠不溶于水和普通有機(jī)溶劑，能忍受濃鹽、尿素和服鹽等溶液的浸泡；在pHl—10或短時(shí)間超過此pH范圍的溶液中較穩(wěn)定；要避免長期與強(qiáng)酸和強(qiáng)堿接觸，如果與其接觸，并在高溫條件下，酰胺基將迅速發(fā)生分解。聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象，如使用離子強(qiáng)度略高的洗脫液操作，此弊病可以克服。23（4）SephacrylSephacryl是由烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)制成的。此凝膠屬硬性凝膠，它具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團(tuán)。Sephacryl吸水時(shí)，其珠狀顆粒直徑平均值為70μm，通常是用于水相系統(tǒng)中。若在有機(jī)相系統(tǒng)使用時(shí)，其孔徑大小略有變化。它在所有的溶劑中不溶解，化學(xué)降解也很少；它可在pH2—11范圍內(nèi)使用，當(dāng)pH低時(shí)，葡聚糖鏈將發(fā)生少許水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室溫下)處理100小時(shí)，對其低流速和多孔性沒有明顯影響。用清潔劑(如SDS)、6mol／L鹽酸胍和8尿素溶液作洗脫劑，高溫消毒(120℃,

pH7)處理后，層析性質(zhì)沒有明顯變化。24分子篩效應(yīng)：大分子先洗脫下來小分子后洗脫下來25也叫凝膠過濾層析26凝膠過濾色譜原理

凝膠層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數(shù)Kav（被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。

27Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)，即：Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值??；反之，則Kav值增大。28在同一凝膠柱上分離Mr不同的物質(zhì)時(shí)，由于流動相的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴(kuò)散效應(yīng)。若緩沖液連續(xù)地傾入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴(kuò)散效應(yīng)也將連續(xù)地發(fā)生，其最終結(jié)果是分子量大的物質(zhì)先從柱中流出，分子量小的物質(zhì)則后從柱中流出。29流出物用部分收集器分管等量或等時(shí)地收集起來，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，即等于把分子量不同的物質(zhì)相互分離開了。30其分離效果受操作條件（如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。分配系數(shù)Kav既是判斷分離效果的一個(gè)參數(shù)，又是測定蛋白質(zhì)分子量的一個(gè)依據(jù)。從公式Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積Vt和外水體積Vo以及洗脫體積Ve，即可計(jì)算出Kav值。31凝膠床總體積Vt可用二種方法得到：計(jì)算法：根據(jù)層析柱體積計(jì)算總體積，可用下列公式表示Vt=r2h式中r為層析柱半徑；h為凝膠床高度；為圓周率。在用此公式計(jì)算凝膠床總體積時(shí)，須精確地分段測量，以防內(nèi)徑不勻造成誤差。另外還須注意到，在層析過程中，尤其是軟膠的操作壓力要小，以防凝膠床的高度降低。

測量法：由凝膠床的組成可知，床體積Vt等于外水體積Vo、內(nèi)水體積Vi與凝膠顆粒實(shí)際占有體積Vg之和。即Vt=V0+Vi+Vg因Vg與Vt相比很小，可忽略不計(jì)，故Vt=V0+Vi32Vo和Vi可通過實(shí)驗(yàn)測得：

當(dāng)把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時(shí)，其在內(nèi)水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等于外水體積。即Ve=Vo(Kav=0)。然而，溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者能自由進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，凝膠床的洗脫體積Ve應(yīng)等于凝膠床總體積，即Ve=Vt=Vo+Vi(Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進(jìn)入部分凝膠網(wǎng)孔中，故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間（Kav在0-1之間）。33測定外水體積的物質(zhì)——通常選用藍(lán)色葡聚糖2000。該物質(zhì)分子量大（為200萬），呈藍(lán)色，它在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。但是，在測定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，不宜用藍(lán)色葡聚糖2000測定外水體積，因?yàn)樗鼘っ赣形阶饔茫杂袝r(shí)用巨球蛋白代替。測定內(nèi)水體積（Vi）的物質(zhì)——可選用硫酸銨、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它與凝膠無吸附力的小分子物質(zhì)。34凝膠色譜實(shí)驗(yàn)方法與步驟1.葡聚糖凝膠的預(yù)處理取3克葡聚糖凝膠（Sephadex-25）干粉，浸泡于50ml蒸餾水中充分溶脹（室溫，12h），然后反復(fù)傾斜除去表面的懸浮微粒，再加入pH7.0磷酸緩沖液沸水浴中2-3h去除顆粒內(nèi)部空氣，最后加入pH7.0磷酸緩沖液浸泡過夜備用。2.裝柱(1)將層析柱垂直固定在鐵架臺上,不要顛倒；(2)將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約1-2cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊倒入柱中，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的圓形濾紙片，以防將來加樣時(shí)凝膠被沖起。35

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