《儀器》課件 第一節(jié) 概述-1

第三章

色譜分析法2023/2/2第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的由來、分類和作用1.由來2.分類

3.特點二、氣相色譜分離過程

1.氣相色譜分離過程

2.分配系數(shù)K2023/2/2一、色譜法的由來、分類和作用

1.由來俄國植物學家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。

色譜法是一種分離技術(shù)，試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在分離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。色譜分析法定義2023/2/2色譜法

當流動相攜帶混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序從固定相中流出；再與適當?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)2023/2/22.色譜法分類

按流動相可分為：氣相色譜：流動相為氣體（載氣）；液相色譜：流動相為液體。按固定相可分為：氣固色譜和氣液色譜；液固色譜和液液色譜按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細管柱色譜；2023/2/23.氣相色譜法的特點（1）分離效率高：復雜混合物，有機同系物、異構(gòu)體，手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高：可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量.（3）分析速度快：一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。（4）應用范圍廣：適用于沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。不足之處：不適用于高沸點、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。被分離組分的定性較為困難。2023/2/25、液相色譜法的特點

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2023/2/2二、氣相色譜分離過程填充柱色譜:氣固色譜和氣液色譜，兩者的分離機理不同。氣固色譜的固定相:多孔性的固體吸附劑顆粒。

固體吸附劑對試樣中各組分的吸附能力的不同。氣液色譜的固定相:由擔體和固定液所組成。

固定液對試樣中各組分的溶解能力的不同。氣固色譜的分離機理:吸附與脫附的不斷重復過程；氣液色譜的分離機理：氣液兩相間的反復多次分配過程。2023/2/2氣相色譜分離過程當試樣由載氣攜帶進入色譜柱與固定相接觸時，被固定相溶解或吸附。隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附，揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動時又再次被固定相溶解或吸附。隨著載氣的流動，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復地進行。2023/2/2分配系數(shù)K

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：2023/2/2分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。2023/2/2第三章

色譜分析法一、氣相色譜流出曲線二、容量因子與分配系數(shù)三、塔板理論四、速率理論五、分離度第二節(jié)

色譜理論基礎(chǔ)2023/2/2一、氣相色譜流出曲線1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線

2.保留值

（1）時間表示的保留值死時間（tM）：不與固定相作用的惰性物質(zhì)的保留時間。保留時間（tR）：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間。

調(diào)整保留時間（tR＇

)：tR＇=tR－tM

2023/2/2(2)用體積表示的保留值死體積（VM）：VM=tM×F0保留體積（VR）：VR=tR×F0(F0為色譜柱出口處的載氣流量，單位：mL/min)

調(diào)整保留體積（VR＇）：V

R＇=VR－VM

2023/2/23.相對保留值r21組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t’R2

/t’R1=V’R2/V’

R1相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對這兩種組分的選擇性。2023/2/2

4.區(qū)域?qū)挾扔脕砗饬可V峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標準偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：

色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354（3）峰底寬(Wb)：

Wb=42023/2/2二、容量因子與分配系數(shù)

分配系數(shù)K：組分在兩相間的濃度比；容量因子k：平衡時，組分在各相中的質(zhì)量比；

k=MS/MmMS為組分在固定相中的質(zhì)量，Mm為組分在流動相中的質(zhì)量。容量因子k與分配系數(shù)K的關(guān)系為：式中β為相比。填充柱相比：6～35；毛細管柱的相比：50～1500容量因子越大，保留時間越長?？捎杀Ａ魰r間計算出容量因子，兩者有以下關(guān)系：2023/2/2塔板理論基本假設(shè)：將色譜柱視為精餾塔1）塔板之間不連續(xù)；2）塔板之間無分子擴散；3）組分在各塔板內(nèi)兩相間的分配瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論塔板高度H；4）某組分在所有塔板上的分配系數(shù)相同；5）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入。三、塔板理論-柱分離效能指標2023/2/2色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：2023/2/2有效塔板數(shù)和有效塔板高度單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在tM時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：2023/2/2塔板理論的特點和不足：

(1)當色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質(zhì)。

(3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。

(4)(不足)該理論是在理想情況下導出的，未考慮分子擴散因素、其它動力學因素對柱內(nèi)傳質(zhì)的影響。因此它不能解釋：a.峰形為什么會擴張？b.影響柱效的動力學因素是什么？2023/2/2四、速率理論-影響柱效的因素

速率方程（也稱范·弟姆特方程式）:

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s)減小A、B、C三項可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項各與哪些因素有關(guān)？2023/2/21.渦流擴散項－A

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充得越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。2023/2/22.

分子擴散項—BB=2νDgν

：彎曲因子，填充柱色譜，ν<1。Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2·s-1）。由于柱中存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴散：a.擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差。b.分子擴散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴散↑c.擴散系數(shù)：Dg∝（M載氣）-1/2；M載氣↑，B值↓2023/2/23.傳質(zhì)阻力項—C

組分在氣相和液相兩相間進行反復分配時，遇到阻力。傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL，液相傳質(zhì)阻力大于氣相傳質(zhì)阻力。即：C=（Cg+CL）2023/2/24.載氣流速與柱效-最佳流速

載氣流速高時：

傳質(zhì)阻力項是影響柱效的主要因素，流速，柱效,右圖曲線的右邊。

載氣流速低時：

H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導數(shù)有一極小值。

以塔板高度H對應載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。

分子擴散項成為影響柱效的主要因素，流速，柱效

，右圖曲線的坐邊。2023/2/25.速率理論的要點(1)組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。(2)通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響(選擇柱溫的根據(jù)是混合物的沸點范圍，固定液的配比和檢測器的靈敏度。提高柱溫可縮短分析時間；降低柱溫可使色譜柱選擇性增大，有利于組分的分離和色譜柱穩(wěn)定性提高，柱壽命延長。一般采用等于或高于數(shù)十度于樣品的平均沸點的柱溫為較合適，對易揮發(fā)樣用低柱溫，不易揮發(fā)的樣品采用高柱溫)。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。2023/2/2五、分離度

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過程的熱力學因素(組分與固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))；區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動力學因素(兩項中的運動阻力和擴散)。

色譜分離中的四種情況如圖所示：①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。2023/2/2分離度的表達式：R=0.8：兩峰的分離程度可達89%；R=1.0：分離程度98%；R=1.5：達99.7%（相鄰兩峰完全分離的標準）。2023/2/2令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相鄰兩峰的峰底寬近似相等），引入相對保留值和塔板數(shù)，可導出下式：2023/2/2分離度與柱效的關(guān)系

雖說用較長的柱可以提高分離度，但延長了分析時間。因此提高分離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過降低板高，以提高分離度。2023/2/2分離度與相對保留值r21的關(guān)系

由基本色譜方程式判斷，當r21=1時，R=0，這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組分分離。顯然，r21大，選擇性好。研究證明，r21的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。措施：一般通過改變固定相和流動相的性質(zhì)和組成或降低柱溫，可有效增大r21值。2023/2/2例1：在一定條件下，兩個組分的調(diào)整保留時間分別為85秒和100秒，要達到完全分離，即R=1.5。計算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長是多少？解：分離度應用示例2023/2/2例1：在一定條件下，兩個組分的調(diào)整保留時間分別為85秒和100秒，要達到完全分離，即R=1.5。計算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長是多少？解：γ2,1

=100/85=1.18

n有效=16R2[γ2,1/(γ2,1

—1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1548（塊）

L有效=n有效·H有效=1548×0.1=155cm即柱長為1.55米時，兩組分可以得到完全分離。2023/2/2[例2]已知一色譜柱在某溫度下的速率方程的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳線速度u和最小塔板高H.2023/2/2[例2]已知一色譜柱在某溫度下的速率方程的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳線速度u和最小塔板高H.

解:欲求u最佳和H最小,要對速率方程微分,即dH/du＝d(A+B/u+Cu)/du＝-B/u2+C＝0而,最佳線速:u最佳＝(B/C)1/2最小板高:H最?。紸+2(BC)1/2可得u最佳＝(0.65/0.003)1/2＝14.7cm/sH最小＝0.08+2(0.65×0.003)1/2＝0.17cm2023/2/2[例3]已知物質(zhì)A和B在一個30.0cm柱上的保留時間分別為16.40和17.63min.不被保留組分通過該柱的時間為1.30min.峰寬為1.11和1.21min,計算:

(1)柱的分離度;

(2)柱的平均有效塔板數(shù)目;

(3)平均有效塔板高度;

2023/2/2

解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)nA=16[(16.40-1.30)/1.11]2=2961nB=16[(17.63-1.30)/1.21]2=2915nav=(2961+2914)/2=2938(3)H=L/n=30.0/2938=1.02×10-2cm

[例3]已知物質(zhì)A和B在一個30.0cm柱上的保留時間分別為16.40和17.63min.不被保留組分通過該柱的時間為1.30min.峰寬為1.11和1.21min,計算:

(1)柱的分離度;

(2)柱的平均有效塔板數(shù)目;

(3)平均有效高度;2023/2/2例2：在根長為1米的填充柱上，空氣的保留時間為5s，苯和環(huán)己烷的保留時間分別為45s和49s，環(huán)己烷色譜峰峰底寬為5s。欲得到R＝1.2的分離度，有效理論塔板數(shù)應為多少？需要的柱長應為多少？解：2023/2/2例4：在根長為1米的填充柱上，空氣的保留時間為5s，苯和環(huán)己烷的保留時間分別為45s和49s，環(huán)己烷色譜峰峰底寬為5s。欲得到R＝1.2的分離度，有效塔板數(shù)應為多少？需要的柱長應為多少？解：根據(jù)公式n有效=16R2[γ2,1/(γ2,1—1)]2r21=t’R2/t’R1neff=16×R2×[γ2,1/(γ2,1—1)]2=16×1.22×(1.1/0.1)2=2788塊L＝2.25m2023/2/2一、氣相色譜儀及其流程二、載氣種類和流速的選擇三、進樣操作的選擇四、氣相色譜固定相五、氣相色譜檢測裝置

1．檢測器特性

2．熱導檢測器

3．氫火焰離子化檢測器

4.電子捕獲檢測器

5.具有定性功能的檢測器（聯(lián)用技術(shù)）第三節(jié)

氣相色譜裝置及操作條件的選擇2023/2/2一、氣相色譜流程1.載氣系統(tǒng)：包括氣源、凈化干燥管和載氣流速控制;2.進樣系統(tǒng)：進樣器及氣化室；3.色譜柱：填充柱（填充固定相）或毛細管柱（內(nèi)壁涂有固定液）；4.檢測器：可連接各種檢測器，以熱導檢測器或氫火焰檢測器最為常見；5.記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀或數(shù)據(jù)處理儀；6.溫度控制系統(tǒng)：柱室、氣化室和檢測器的溫度控制。2023/2/2二、載氣種類和流速的選擇1.載氣種類的選擇

載氣種類的選擇應考慮三個方面：載氣對柱效的影響、檢測器要求及載氣性質(zhì)。

(1)載氣摩爾質(zhì)量大，可抑制試樣的縱向擴散，提高柱效。

(2)載氣流速較大時，傳質(zhì)阻力項起主要作用，采用較小摩爾質(zhì)量的載氣（如H2，He），可減小傳質(zhì)阻力，提高柱效。

(3)熱導檢測器需要使用熱導系數(shù)較大的氫氣有利于提高檢測靈敏度。在氫焰檢測器中，氮氣仍是首選目標。(4)在載氣選擇時，還應綜合考慮載氣的安全性、經(jīng)濟性及來源是否廣泛等因素。2023/2/22.載氣流速的選擇

作圖求最佳流速。實際流速稍大于最佳流速，縮短時間。2023/2/2

三、進樣操作的選擇1.進樣方式和進樣量的選擇

液體試樣采用色譜微量進樣器進樣，規(guī)格有1μL，5μL，10μL等。進樣量應控制在柱容量允許范圍及檢測器線性檢測范圍之內(nèi)。進樣要求動作快、時間短。氣體試樣應采氣體進樣閥進樣。2023/2/22.氣化溫度的選擇色譜儀進樣口下端有一氣化器，液體試樣進樣后，在此瞬間氣化;氣化溫度一般較柱溫高30~70℃防止氣化溫度太高造成試樣分解。2023/2/2四、氣相色譜固定相1．氣固色譜固定相

種類：

活性炭：有較大的比表面積，吸附性較強。

活性氧化鋁：有較大的極性。適用于常溫下O2、N2、CO、CH4、C2H6、C2H4等氣體的相互分離。CO2能被活性氧化鋁強烈吸附而不能用這種固定相進行分析。

硅膠：與活性氧化鋁大致相同的分離性能，除能分析上述物質(zhì)外，還能分析CO2、N2O、NO、NO2等，且能夠分離臭氧。2023/2/2分子篩：堿及堿土金屬的硅鋁酸鹽(沸石),多孔性。如3A、4A、5A分子篩等(孔徑：埃)。常用5A(常溫下分離O2與N2)。除了廣泛用于H2、O2、N2、CH4、CO等的分離外，還能夠測定He、Ne、Ar、NO、N2O等。高分子多孔微球（GDX系列）：新型有機合成固定相（苯乙烯與二乙烯苯共聚）。型號：GDX-01、-02、-03，適用于水、氣體及低級醇的分析。2023/2/2（1）性能和制備與活化條件有很大關(guān)系；（2）同一種固定相，不同廠家或不同活化條件，分離效果差異較大；（3）種類有限，能分離的對象不多；（4）使用方便。2.氣固色譜固定相的特點2023/2/23.固定相的選擇

氣－液色譜，應根據(jù)“相似相溶”的原則①分離非極性組分時，通常選用非極性固定相。各組分按沸點順序出峰，低沸點組分先出峰。②分離極性組分時，一般選用極性固定液。各組分按極性大小順序流出色譜柱，極性小的先出峰。③分離非極性和極性的（或易被極化的）混合物，一般選用極性固定液。此時，非極性組分先出峰，極性的（或易被極化的）組分后出峰。2023/2/2

④醇、胺、水等強極性和能形成氫鍵的化合物的分離，通常選擇極性或氫鍵性的固定液。

⑤組成復雜、較難分離的試樣，通常使用特殊固定液，或混合固定相。2023/2/24.固定液配比（涂漬量）的選擇

配比：固定液在擔體上的涂漬量，一般指的是固定液與擔體的百分比，配比通常在5%～25%之間。

配比越低，擔體上形成的液膜越薄，傳質(zhì)阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。配比較低時，固定相的負載量低，允許的進樣量較小。分析工作中通常傾向于使用較低的配比。2023/2/2

5.柱長和柱內(nèi)徑的選擇

增加柱長對提高分離度有利（分離度R正比于柱長L2），但組分的保留時間tR↑，且柱阻力↑，不便操作。柱長的選用原則是在能滿足分離目的的前提下，盡可能選用較短的柱，有利于縮短分析時間。填充色譜柱的柱長通常為1~3米，內(nèi)徑3~4mm。2023/2/26.柱溫的確定

(1)首先應使柱溫控制在固定液的最高使用溫度（超過該溫度固定液易流失）和最低使用溫度（低于此溫度固定液以固體形式存在）范圍之內(nèi)。(2)柱溫↑，被測組分的揮發(fā)度↑，即被測組分在氣相中的濃度↑，K↓，tR↓，低沸點組份峰易產(chǎn)生重疊。(3)柱溫↓，分離度↑，分析時間↑。對于難分離物質(zhì)對，降低柱溫雖然可在一定程度內(nèi)使分離得到改善，但是不可能使之完全分離，這是由于兩組分的相對保留值增大的同時，兩組分的峰寬也在增加，當后者的增加速度大于前者時，兩峰的交疊更為嚴重。2023/2/2(4)柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點時的溫度。(5)組分復雜，沸程寬的試樣，采用程序升溫。程

序

升

溫2023/2/2五、氣相色譜檢測裝置

色譜儀的關(guān)鍵部件之一，種類較多，原理和結(jié)構(gòu)各異。有的具有廣泛性，如熱導檢測器；有的具有高選擇性，僅對某類物質(zhì)有高響應。1．檢測器特性

濃度型檢測器：測量的是載氣中通過檢測器組分濃度瞬間的變化，檢測信號值與組分的濃度成正比。

質(zhì)量型檢測器：測量的是載氣中某組分進入檢測器的速度變化，即檢測信號值與單位時間內(nèi)進入檢測器組分的質(zhì)量成正比。2023/2/2檢測器性能評價指標靈敏度S

在一定范圍內(nèi)，信號E與進入檢測器的物質(zhì)質(zhì)量m呈線性關(guān)系：E=SmS=E/m

單位：mV/（mg/cm-3）；（濃度型檢測器）

mV/（mg/s）；（質(zhì)量型檢測器）

S表示單位質(zhì)量的物質(zhì)通過檢測器時，產(chǎn)生的響應信號的大小。S值越大，檢測器（也即色譜儀）的靈敏度也就越高。檢測信號通常顯示為色譜峰，則響應值也可以由色譜峰面積（A）除以試樣質(zhì)量求得：S=A/m2023/2/2最低檢測限（最小檢測量）噪聲水平?jīng)Q定著能被檢測到的濃度（或質(zhì)量）。

從圖中可以看出：如果要把信號從本底噪聲中識別出來，則組分的響應值就一定要高于N。檢測器響應值為2倍噪聲水平時的試樣濃度（或質(zhì)量），被定義為最低檢測限（或該物質(zhì)的最小檢測量）。線性范圍：

色譜定量分析要求檢測器的響應信號與進樣量之間成線性關(guān)系。檢測器的線性范圍定義為在檢測器呈線性時，最大和最小進樣量之比，這個比值越大，線性范圍越寬，越有利于對大量組分或微量組分的準確定量。2023/2/22023/2/22.熱導檢測器（1）熱導檢測器的結(jié)構(gòu)如圖所示池體：一般用不銹鋼制成。熱敏元件：電阻率高、電阻溫度系數(shù)大、且價廉易加工的鎢絲制成。參考臂：僅允許純載氣通過，通常連接在進樣裝置之前。測量臂：需要攜帶被分離組分的載氣流過，則連接在緊靠近分離柱出口處。2023/2/22023/2/2（2）檢測原理

平衡電橋，右圖。

不同的氣體有不同的熱導系數(shù)。

鎢絲通電，加熱與散熱達到平衡后，兩臂電阻值：

R參=R測;R1=R2

則：R參·R2=R測·R1

無電壓信號輸出；記錄儀走直線（基線）。

進樣后，載氣攜帶試樣組分流過測量臂而這時參考臂流過的仍是純載氣，使測量臂的溫度改變，引起電阻的變化，測量臂和參考臂的電阻值不等，產(chǎn)生電阻差,R參≠R測

則：R參·R2≠R測·R1

這時電橋失去平衡，a、b兩端存在著電位差，有電壓信號輸出。信號與組分濃度相關(guān)。記錄儀記錄下組分濃度隨時間變化的峰狀圖形。2023/2/2（3）影響熱導檢測器靈敏度的因素①橋路電流I：

I，鎢絲的溫度，鎢絲與池體之間的溫差，有利于熱傳導，檢測器靈敏度提高。檢測器的響應值S∝I3，但穩(wěn)定性下降，基線不穩(wěn)。橋路電流太高時，還可能造成鎢絲燒壞。②池體溫度：池體溫度與鎢絲溫度相差越大，越有利于熱傳導，檢測器的靈敏度也就越高，但池體溫度不能低于分離柱溫度，以防止試樣組分在檢測器中冷凝。2023/2/2表1-3某些氣體與蒸氣的熱導系數(shù)(λ)，單位：J/cm·℃·s③載氣種類：載氣與試樣的熱導系數(shù)相差越大，在檢測器兩臂中產(chǎn)生的溫差和電阻差也就越大，檢測靈敏度越高。載氣的熱導系數(shù)大，傳熱好，通過的橋路電流也可適當加大，則檢測靈敏度進一步提高。氦氣也具有較大的熱導系數(shù)，但價格較高。2023/2/2

3.氫火焰離子化檢測器（1）特點a.典型的質(zhì)量型檢測器，b.對有機化合物具有很高的靈敏度，c.無機氣體、水、四氯化碳等含氫少或不含氫的物質(zhì)靈敏度低或不響應。d.氫焰檢測器結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高,響應迅速等特點。e.比熱導檢測器的靈敏度高出近3個數(shù)量級,檢測下限可達10-12g/mL

。2023/2/2(2)氫火焰檢測器的結(jié)構(gòu)a.在發(fā)射極和收集極之間加有一定的直流電壓（100～300V）構(gòu)成一個外加電場。b.氫焰檢測器需要用到三種氣體：

N2：載氣攜帶試樣組分；H2：為燃氣；空氣：助燃氣。使用時需要調(diào)整三者的比例關(guān)系，檢測器靈敏度達到最佳。2023/2/2(3)氫火焰檢測器的原理

a.當含有機物CnHm的載氣由噴嘴噴出進入火焰時，在C層發(fā)生裂解反應產(chǎn)生自由基：CnHm──→·CHb.產(chǎn)生的自由基在D層火焰中與外面擴散進來的激發(fā)態(tài)原子氧或分子氧發(fā)生如下反應：·CH+O──→CHO++ec.生成的正離子CHO+與火焰中大量水分子碰撞而發(fā)生分子離子反應：CHO++H2O──→H3O++COA區(qū)：預熱區(qū)B層：點燃火焰C層：熱裂解區(qū)：溫度最高D層：反應區(qū)2023/2/2氫焰檢測器的原理

d.化學電離產(chǎn)生的正離子和電子在外加恒定直流電場的作用下分別向兩極定向運動而產(chǎn)生微電流（約10-6～10-14A）；e.在一定范圍內(nèi)，微電流的大小與進入離子室的被測組分質(zhì)量成正比，所以氫焰檢測器是質(zhì)量型檢測器；f.組分在氫焰中的電離效率很低，大約五十萬分之一的碳原子被電離；g.離子電流信號輸出到記錄儀，得到峰面積與組分質(zhì)量成正比的色譜流出曲線。A區(qū)：預熱區(qū)B層：點燃火焰C層：熱裂解區(qū)：溫度最高D層：反應區(qū)2023/2/2（4）影響氫火焰檢測器靈敏度的因素

①各種氣體流速和配比的選擇：N2流速的選擇主要考慮分離效能，N2H2=11～11.5氫氣空氣=110。②極化電壓正常極化電壓選擇在100～300V范圍內(nèi)。2023/2/24.電子捕獲檢測器

高選擇性檢測器，僅對含有鹵素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的靈敏度，檢測下限10-14g/mL，

對大多數(shù)烴類沒有響應。較多應用于農(nóng)副產(chǎn)品、食品及環(huán)境中農(nóng)藥殘留量的測定。2023/2/25.具有定性功能的檢測器（聯(lián)用技術(shù)）色譜-質(zhì)譜；色譜-紅外等。

質(zhì)譜作為色譜的檢測器使用需要解決四個問題:(1)色譜柱出口壓力與質(zhì)譜儀高真空之間的匹配；(2)試樣組分與載氣的分離；(3)質(zhì)譜對色譜流出峰的快速測定(電子計算機解決)；(4)質(zhì)譜儀的小型化（小型化的質(zhì)量分析器）。2023/2/2第四章

色譜分析法第四節(jié)

色譜定性、定量分析方法一、色譜定性鑒定方法二、色譜定量分析方法2023/2/2一、色譜定性定量方法

色譜分析分為三個階段：(1)儀器調(diào)試(2)操作條件選擇(3)定性---保留值，定量---峰高,峰面積色譜法分離好,定性難色譜定性方法色譜定量分析2023/2/21.色譜定性方法

1.用已知物對照定性

保留時間和保留體積定性、比保留體積定性、相對保留值定性、加入已知物增加峰高定性，雙柱定性2.利用文獻的保留值數(shù)據(jù)定性3.利用保留值的經(jīng)驗規(guī)律定性

碳數(shù)規(guī)律、沸點規(guī)律2023/2/2利用保留時間和保留體積定性

在色譜固定相和操作條件一定時，試樣的每種組分均有確定的色譜保留值，因而保留值是色譜定性的基本參數(shù)。即各組分的tR或vR可作為定性的指標。tR隨載氣流速的變化而變化，使用時要注意控制載氣流速，而vR不受流速變化的影響。測定時只要在相同的操作條件下，分別測出已知物和未知樣的保留值，比較二者的保留值是否相同，如相同，則兩者為同一種物質(zhì)。優(yōu)點：簡單缺點：要有純樣，適用于已知物，操作條件要穩(wěn)定

示例2023/2/22023/2/2利用比保留體積定性

利用比保留體積定性，可不受柱長、柱內(nèi)徑、固定液含量和流速的影響。實驗時，利用Vg進行比較定性,Tc為臨界溫度,VN為在絕對溫度時測量的保留體積。

2023/2/2利用相對保留值定性

利用保留值定性，需要嚴格控制操作條件，否則重復性差。而用相對保留值定性，則可消除某些操作條件的影響。令某一組分為s，其它各組分以i表示，分別計算已知物各組分的ris和混合物各色譜峰的ris值后，通過比較對應的ris值，其值相同者為同一物質(zhì)。優(yōu)點：比絕對法重現(xiàn)性好缺點：也需要純樣，比絕對法麻煩2023/2/2利用加入已知物增加峰高定性

如果相鄰兩組分的峰間距太小，或操作條件不易控制穩(wěn)定，因而不易測準保留值時,可采用增加峰高的方法定性。此法是將已知物加入試樣中,如果由混合后得色譜圖上的某組分峰高有所增加,則可以認為試樣中含有所加入的這一物質(zhì)。2023/2/2利用雙柱定性

有時不同組分在同一根色譜柱上具有相同的保留值，例如１－丁烯與異丁烯在阿皮松硅油等非極性柱上具有相同的保留值，此時可采用雙柱法定性，該法對于同系物的定性更有利。在一根柱子上保留值相同的化合物，在另一根柱上保留值不同，分別是當兩根柱子極性差大時，保留值差別更大。因此，選擇分離的兩根柱子極性差應盡量大。如果用純樣品校對，也需在兩根柱上觀察標樣峰與未知峰是否始終重合。2023/2/22.利用文獻的保留值數(shù)據(jù)定性

在某些情況下，可利用文獻發(fā)表的保留值來定性。通常用的有相對保留值和保留指數(shù)，只要能重現(xiàn)其要求的操作條件，這些定性數(shù)據(jù)還是可靠的。利用相對保留值定性的方法前面已介紹。保留指數(shù)Ix在許多文獻上都可查到，它至今仍是柱保留值最有價值的表達形式。保留指數(shù)是把物質(zhì)的保留行為用兩個緊靠近它的標準物（一般是兩個正構(gòu)烷烴）來標定。并以均一標度來表示。在任何情況下，正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)，規(guī)定為其碳數(shù)乘以100。例如正己烷和正庚烷的保留指數(shù)分別為600和700，而其它物質(zhì)的保留指數(shù)則需在色譜條件下以相鄰的正構(gòu)烷烴為參比物進行測定。2023/2/2某物質(zhì)的保留指數(shù)按下式計算：

式中：t’R

為調(diào)整保留時間；x為被測物；z為具有z個碳原子的正構(gòu)烷烴；z+1為具有z+1個碳原子的正構(gòu)烷烴。利用上式求出未知物的保留指數(shù)，然后與文獻數(shù)據(jù)對照，即可對未知物進行定性。確定方法：將碳原子數(shù)為Z和Z+1的正構(gòu)烷烴加入樣品X中進行分析，測得它們的調(diào)整保留時間，并要求：t′R（Z）<t′R（X）<t′R（Z+1），2023/2/2優(yōu)點：測得Ix值與文獻值對照就可定性。缺點：1.要有正構(gòu)烷烴純樣。

2.可供查閱的文獻值太少。

3．柱子與柱溫要與文獻規(guī)定相同2023/2/2例題：在某色譜條件下，文獻報道，甲基乙基酮的IX為616，環(huán)己烷的IX為585，現(xiàn)有兩種物質(zhì)，為對其進行定性，按文獻報道的色譜條件，測量了該組分以及幾種正構(gòu)烷烴的保留值，結(jié)果為：n-丁烷t′R=2.21min，n-戊烷t′R=4.10minn-己烷t′R=7.61min，n-庚烷t′R=14.08mint′R(A)=9.83mint′R(B)=8.4min試判斷A、B是否為甲基乙基酮或環(huán)己烷。2023/2/2解：可見：B物質(zhì)是甲基乙基酮A物質(zhì)既不是甲基乙基酮，也不是環(huán)己烷2023/2/2碳數(shù)規(guī)律

當一個混合物中某幾個組分缺乏純物質(zhì)，而且又無已知的保留數(shù)據(jù)時，可利用下面兩個經(jīng)驗規(guī)律，通過作圖求得保留值，從而對未知物進行定性。碳數(shù)規(guī)律是在一定的溫度下，同系物的調(diào)整保留時間的對數(shù)與分子中的碳原子數(shù)n成正比（n=1、2時可能有偏差）：

式中：A1、c1是與固定液和被分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)的經(jīng)驗常數(shù)。利用此經(jīng)驗規(guī)律定性時，先測出同系物中幾個已知組分的調(diào)整保留時間，用這些調(diào)整保留時間與相應的碳原子數(shù)作圖，根據(jù)該圖求出同系物中其它組分的調(diào)整保留時間，再與相同條件下測得的未知峰的調(diào)整保留時間對照定性。碳數(shù)規(guī)律只適用于同系物，而不適用于同族化合物。

2023/2/2沸點規(guī)律

與碳數(shù)規(guī)律一樣，同系物中比保留體積的對數(shù)與其沸點Tb成比例。同碳數(shù)的碳鏈異構(gòu)物的比保留體積的對數(shù)與其沸點也有這種關(guān)系：式中A2、c2為經(jīng)驗常數(shù)。利用沸點規(guī)律時，先用幾個能得到的同系物組分作出lgVg-Tb圖，根據(jù)未知物的沸點，找出相應的lgVg值，與待測組分的峰對照定性。

2023/2/22.色譜定量分析

在一定的操作條件下，檢測器的響應信號（色譜圖上的峰面積或峰高）與進入檢測器的組分i的重量或濃度成正比。即：或上式即為氣相色譜定量分析的依據(jù)。顯然要準確進行定量分析，必須要：（1）準確的測量峰面積Ai（2）求出定量校正因子fi（3）正確地選用定量計算方法2023/2/2一、峰面積的測量方法

峰面積測量的準確度直接影響定量結(jié)果。對于不同峰形的色譜峰必須采用不同的測量方法，才能取得較好的結(jié)果，常見的峰形主要有對稱峰和不對稱峰兩類。峰面積的測量方法有

峰高乘半峰寬法近似測量法:

峰高乘平均峰寬法

峰高乘保留時間法

自動積分儀法真實測量法：

求積儀（或叫面積儀）2023/2/21.峰高乘半峰寬法該法是把對稱色譜峰看作一個等腰三角形，根據(jù)等腰三角形面積的計算方法，可近似認為峰面積（A）等于峰高（h）與半峰寬（Y1/2）的乘積。這樣測得的峰面積只有真實面積的0.94倍，實際峰面積應為：在作相對計算時，1.065可以略去，不影響測定結(jié)果。但在作絕對測量時，如測靈敏度，比表面積時，1.065就不能省略。此法簡便，是一種最常用的近似方法。它主要用于對稱峰。不對稱峰不能應用，很窄和很小的峰的半峰寬測量誤差很大。2023/2/22.峰高乘平均峰寬法對于不對稱的色譜峰，可采用此法。所謂平均峰寬是指在峰高0.15和0.85處分別測峰寬，然后取其平均值，由此測得的峰面積為：

此法雖有測量上的麻煩，但結(jié)果還是比較準確。2023/2/23.峰高乘保留時間法

在一定的操作條件下，同系物的半峰寬與保留時間成正比，即：將Y1/2值代入前面式子中得：式中b為常數(shù)，在作相對測量時，1.065和b均可約去。此法簡便、快速而準確，特別適用于窄峰和分離不到一半峰的峰面積測量。對含量相差懸殊的峰、非同系物的峰不適用。2023/2/24.自動積分儀法

自動積分儀可自動測出某一曲線所圍成的面積，是最方便的一種測量工具。此法對不對稱峰和對稱峰都能快速和準確測量，其精密度可達0.2~2%。但測量較小峰時，誤差較大。

5.求積儀（或叫面積儀）法求積儀法是用平動的方法測量峰面積，可準確到0.1cm2。方法的精密度隨峰面積減小而降低，此時可以加大紙速，以增大峰面積，并重復多測幾次，以降低測量相對誤差。此法多用于不對稱色譜峰。2023/2/2二、定量校正因子

色譜分析的定量依據(jù)是，在一定的操作條件下，進樣量與峰面積成正比。但由于同一種檢測器對不同物質(zhì)有不同的靈敏度，故等量的不同物質(zhì)通過檢測器時，所產(chǎn)生的峰面積就不相等，因而不能直接用峰面積來計算物質(zhì)的含量。為了使峰面積能真實地反映出物質(zhì)的含量，就需用定量因子對峰面積進行校正。校正因子的表示法

校正因子的測量2023/2/21.校正因子的表示法

由式得

式中：fi為絕對校正因子，即單位峰面積所代表的物質(zhì)量。fi主要由儀器的靈敏度來決定，既不容易測準也無法應用，但物質(zhì)的相對響應值相同，所以在定量分析中都是用相對校正因子f/i，即為某物質(zhì)與一標準物質(zhì)s的絕對校正因子之比值。熱導池檢測器用苯作為標準物，氫火焰檢測器用正庚烷作為標準物，由于被測物質(zhì)使用的計量單位不同，校正因子又可分為：“重量校正因子”、“摩爾校正因子”、“體積校正因子”。（通常把相對二字略去）。相對響應值2023/2/2重量校正因子（）這是一種最重要的定量校正因子。式中：Ai、As、mi、ms分別為待測物和標準物的峰面積和重量。

2023/2/2摩爾校正因子（）即

式中：Mi、Ms分別為被測物和標準物的分子量。

2023/2/2體積校正因子（）

如果樣品為氣體也可以用體積校正因子，則體積校正因子就是摩爾校正因子，因為一摩爾任何物質(zhì)在條件相同時的體積相同，比如一摩爾任何物質(zhì)在標準狀態(tài)下都是22.4升。

對于氣體樣品，用摩爾校正因子，可得體積百分數(shù)

2023/2/2相對響應值（）

相對響應值也叫相對應答值，是被測物質(zhì)i和標準物質(zhì)s的絕對響應值之比：

相對響應值與相對校正因子的關(guān)系是，當計量單位相同時就互為倒數(shù)，即：2023/2/22.校正因子的測量校正因子的測量方法是準確稱量被測組分和標準物質(zhì)，混均后在實驗條件下進行分析，注意進樣量應在檢測器的線性范圍之內(nèi)。測量各峰面積，由和

計算重量校正因子、摩爾校正因子。如果幾次測量數(shù)值接近，可取其平均值。校正因子除自己測定外，也可以引用文獻上所發(fā)表的數(shù)據(jù)。2023/2/2三、定量方法

目前常用的定量方法主要有歸一化法，內(nèi)標法和外標法三種。這些定量方法各有其優(yōu)缺點和適用范圍，應根據(jù)實際情況，正確選用。歸一化法內(nèi)標法外標法2023/2/2歸一化法當試樣中所有組分都能流出色譜柱，且在檢測器上都能產(chǎn)生信號時，可用此法計算組分含量。當測量參數(shù)為峰面積時，歸一化的計算公式為：

式中f/i為幾個組分中i組分的峰面積校正因子。如試樣中各組分的校正因子很接近，則上式可簡化為：2023/2/2當測量參數(shù)為峰高時，歸一化法的計算公式為：

式中：fih為幾個組分中i組分的峰高校正因子，須自行測定。測定方法與峰面積校正因子相同。

特點及要求：

歸一化法簡便、準確；進樣量的準確性和操作條件的變動對測定結(jié)果影響不大；僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。2023/2/2內(nèi)標法

當混合物中所有組分不能全部流出色譜柱，或檢測器不能對各組分都產(chǎn)生信號，或只需測定混合物中某幾個組分時，可采用此法定量。內(nèi)標法就是準確稱取樣品量，加入一定量的某種物質(zhì)作內(nèi)標物，根據(jù)被測物和內(nèi)標物的重量及其色譜圖上響應的峰面積比求出被測物組分的含量。(以固定的濃度加入標準溶液和樣品溶液中的作用：以抵消實驗條件和進樣量變化帶來的誤差)

一般常以內(nèi)標物作為基準，則f，s=1。2023/2/2對內(nèi)標法的討論內(nèi)標法的要求是，當選擇一個適宜的內(nèi)標（樣品中不存在的）和分離條件，使內(nèi)標和其它組分完全分離；內(nèi)標峰和被測峰要靠近；加入內(nèi)標的量要接近被測組分含量，稱樣時要準確稱取。內(nèi)標法的優(yōu)點：定量準確，限制條件少。內(nèi)標法的缺點：每次分析都要準確稱量，不適于快速控制分析。2023/2/2外標法外標法又稱已知樣校正法或標準曲線法。其方法是先用純物質(zhì)配成不同含量的標樣，然后在一定的操作條件下，分別取一定體積的標樣，注入色譜儀，得到色譜圖，測出峰面積（或峰高），作出峰面積（或峰高）對含量的標準曲線。當試樣中被測組分濃度變化不大時，例如工廠里控制分析的試樣，對這樣的試樣可不必做標準曲線，而用單點校正法來分析。外標法的優(yōu)點：操作簡單，計算方便，不必用校正因子，不必加內(nèi)標物。缺點是進樣量的重復性要好，操作條件要穩(wěn)定，否則對結(jié)果的準確性影響較大。2023/2/2標準曲線

分析時，注入同樣體積的分析試樣，根據(jù)所得峰面積，由標準曲線上查出其百分含量。2023/2/2舉例1.用氣相色譜法分析二甲苯氧化母液中間二甲苯含量，稱取樣品0.1250g，加入正壬烷內(nèi)標0.06258g，間二甲苯的校正因子為0.96，正壬烷校正因子為1.02，間二甲苯的峰面積為3.5cm2，正壬烷峰面積為12cm2。求樣品中間二甲苯的百分含量。解：根據(jù)內(nèi)標法計算公式，間二甲苯的百分含量χi為

χi(%)=msAifi，/Asfs，m×100%=(0.0625×3.5×0.96)/(0.1250×12×1.02)×100%=13.73%2023/2/22.分析試樣中鄰二甲苯、對二甲苯和間二甲苯三個組分，對其他組分不進行定量分析，若選用甲苯為內(nèi)標物，稱取試樣質(zhì)量為0.4385g，甲苯質(zhì)量為0.0530g，相對校正因子及各組分色譜峰面積如下：計算鄰二甲苯、對二甲苯和間二甲苯三個組分的質(zhì)量分數(shù)解：

Pi%=mi/m×100%=Aifi，ms/ASfs，m×100%計算得到m鄰二甲苯％=39.6％；m對二甲苯％=24.8％；m間二甲苯％=10.2％組分鄰二甲苯對二甲苯間二甲苯甲苯f，A0.873.581.411.381.170.6831.000.952023/2/2第四章

高效液相色譜法一、高效液相色譜法的特點二、流程及主要部件三、流動相的選擇四、高效液相色譜法的應用2023/2/2液相色譜是以液體為流動相的色譜分析方法。英文縮寫：LC。按其固定相的不同，又可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）液相色譜簡介2023/2/2氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學性質(zhì)穩(wěn)定的有機化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)?，F(xiàn)在，HPLC的應用范圍已經(jīng)遠遠超過氣相色譜，位居色譜法之首。在所有色譜技術(shù)中，液相色譜法是最早（1903年）發(fā)明的，但其初期發(fā)展較慢，在液相色譜普及之前，紙色譜法、氣相色譜法和薄層色譜法是色譜分析法的主流。到了20世紀60年代后期，將已經(jīng)發(fā)展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術(shù)應用到液相色譜上來，使液相色譜得到了迅速的發(fā)展。特別是填料制備技術(shù)、檢測技術(shù)和高壓輸液泵性能的不斷改進，使液相色譜分析實現(xiàn)了高效化和高速化。具有這些優(yōu)良性能的液相色譜儀于1969年商品化。從此，這種分離效率高、分析速度快的液相色譜就被稱為高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），也稱高壓液相色譜法或高速液相色譜法。

液相色譜的發(fā)展2023/2/2液相色譜的分類

廣義地講，固定相為平面狀的紙色譜法和薄層色譜法也是以液體為流動相，也應歸于液相色譜法。不過通常所說的液相色譜法僅指所用固定相為柱型的柱液相色譜法。

通常將液相色譜法按分離機理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。2023/2/2

類型主要分離機理主要分析對象或應用領(lǐng)域吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜疏水分配作用各種有機化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機離子、有機離子分析離子排斥色譜Donnan膜平衡有機酸、氨基酸、醇、醛分析離子對色譜疏水分配作用離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜立體效應手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析表5－1液相色譜分類返回2023/2/2一、高效液相色譜法的特點

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2023/2/2二、流程及主要部件1.流程2023/2/22.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：15～35×106Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2023/2/2選擇流動相時應注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。返回2023/2/2

應用領(lǐng)域分析對象舉例環(huán)境常見無機陰陽離子、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、硝基化合物、有害重金屬及其形態(tài)、除草劑、農(nóng)藥、酸沉降成分。農(nóng)業(yè)土壤礦物成分、肥料、飼料添加劑、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中無機和有機成分。化工無機化工產(chǎn)品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料。食品無機陰陽離子、有機酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烴。生物氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。醫(yī)藥人體化學成分、各類合成藥物成分、各種天然植物和動物藥物化學成分。返回液相色譜的應用2023/2/2§五高效液相色譜分析高效液相色譜法的出現(xiàn)、儀器及特點

高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu)

高效液相色譜基本原理

高效液相色譜固定相和流動相

高效液相色譜梯度洗脫技術(shù)

高效液相色譜類型簡介

2023/2/2高效液相色譜法的出現(xiàn)由于氣相色譜只能分析M<1000、低沸點、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的組分；對于M>1000、高沸點、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定差的樣品就無能為力了，隨著工業(yè)生產(chǎn)的需要，高效液相色譜的研究成為一個迫切課題。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期，氣相色譜理論迅速發(fā)展以及高壓泵的研制成功，為高效液相色譜的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，高效液相色譜又稱高壓液相色譜法(HPLC)，也稱現(xiàn)代液相色譜。Stein和Moore獲得了1972年的諾貝爾化學獎（研制出氨基酸分析儀）返回2023/2/2高效液相色譜法的特點與經(jīng)典液相色譜比較（四高）

：高壓：壓力可達150~300Kg/cm2。高速：流速為0.1~10.0mL/min。高效：可達5000塊塔板/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度：紫外檢測器靈敏度可達0.01ng(1ng=109g)。同時消耗樣品少。如用Lichrosorb－ODS色譜柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分.2023/2/2與氣相色譜相比

高沸點、熱不穩(wěn)定有機化合物及生化試樣的高效分離分析方法。（l)氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20％。對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。

(2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

（3）氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經(jīng)常可在室溫條件下工作。2023/2/2§5-2高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu)

色譜儀器的流程由液體流動相的輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、信號放大記錄系統(tǒng)組成，其中高壓泵、色譜柱和檢測系統(tǒng)是高效液相色譜的主要部件。

返回2023/2/2輸液系統(tǒng)包括流動相儲液瓶、過濾器、脫氣裝置、高壓泵、壓力脈動阻尼器、梯度洗脫裝置等部件組成

返回2023/2/2脫氣裝置

脫氣就是驅(qū)除溶解在溶劑中的氣體。(1)脫氣是為了防止流動相從高壓柱內(nèi)流出時，釋放出氣泡。這些氣泡進入檢測器后會使噪聲劇增，甚至不能正常檢測。(2)溶解氧會與某些流動相與固定相作用，破壞它們的正常功能。對水及極性溶劑的脫氣尤為重要，因為氧在其中的溶解度較大。

常用的脫氣方法有：低壓脫氣法：電磁攪拌、水泵抽空，可同時加溫或向溶劑吹氮。由于抽空或加熱過程中可能引起流動相中低沸點溶劑的揮發(fā)而影響其組成，此法不適于二元以上溶劑組成的流動相脫氣。吹氦脫氣法：氦氣經(jīng)由一圓筒過濾器通入沖洗劑中，在0.5公斤／厘米壓力下保持10~15分鐘，氦氣的小氣泡可將溶于流動相中的空氣帶出，此法簡單方便，適用于所有沖洗劑脫氣，但由于氦氣價格昂貴，在國內(nèi)尚難于普及。超聲波脫氣法：將溶劑儲液瓶置于超聲波清洗槽中，以水為介質(zhì)超聲脫氣。一般500ml溶劑約需超聲20~30min即可達到驅(qū)氣目的。此法方便，不影響溶劑組成，并適用于各種溶劑，目前國內(nèi)使用較為普遍。返回2023/2/2高壓泵

目前高效液相色譜使用的高壓泵分為恒壓和恒流泵，恒流泵使輸出的液體流量穩(wěn)定，而恒壓泵則使輸出的液體壓力穩(wěn)定。恒流泵中有往復泵、累積型往復泵、注射泵，恒壓泵有氣動放大泵。各種高壓泵均具有以下性能：(1)泵體材料能耐化學腐蝕。通常使用普通耐酸不銹鋼或優(yōu)質(zhì)耐酸不銹鋼。(2)能在高壓下連續(xù)上作。通常要求耐壓40~50MPa·cm-2，能在8~24h連續(xù)上作，壓力平穩(wěn)。(3)輸出流量范圍寬。一般在0.01~10mL/min。(4)輸出流量穩(wěn)定可調(diào)。高效液相色譜使用的檢測器，大多數(shù)對流量變化敏感，高壓輸液泵應提供無脈沖流量。這樣可以降低基線噪聲并獲較好的檢測下限，流量控制的精密度應小于1％，最好為0.5％，重復性最好為0.5％。返回2023/2/2往復泵往復泵有兩類，一種是活塞式，另一種是隔膜式

形成脈沖式供液

返回2023/2/2累積型往復泵

累積型往復泵有兩個泵頭，以串聯(lián)方式連接在一起，這樣可以提供平穩(wěn)的液流。所以如此是因為兩級泵腔排液體積不同，第一級泵腔是第二級泵控的一倍1-高壓流動相出口；2-二級活塞；3-一級活塞；4-流動相

返回2023/2/2注射泵

注射泵類似于注射器，用一臺步進電機驅(qū)動注射泵的活塞把液流從泵腔中擠出．泵腔體積較大(250~500mL)，密封性好的活塞把泵腔中的液體等速流出.

1-電機；2-渦輪；3-螺旋；4-螺桿；5-活塞；6-至色譜柱返回2023/2/2氣動放大泵

氣動放大泵是利用氣體為動力源。適合于液相色譜柱的裝填，近代的液相色譜儀不用這種泵。

1-接色譜柱；2-流動相入口；3-高壓氣入口；4-氣體放空

返回2023/2/2梯度洗脫裝置外梯度:將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入混合室，用高壓輸液泵混合液輸入色譜柱。2023/2/2內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2023/2/2進樣系統(tǒng)通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置和自動進樣系統(tǒng)。分部分進樣和整體進樣。返回2023/2/2分離系統(tǒng)-色譜柱柱材料及規(guī)格柱連接方式柱溫控制柱填充技術(shù)返回2023/2/2柱材料及規(guī)格

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長10～50cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑提高柱效。采用直形柱管，標準填充柱柱管內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，長10~50cm，填料粒度5~10μm時，柱效達5000~10000塊/m理論塔板數(shù)。返回2023/2/2柱連接方式

柱接頭通過過濾片與色譜柱管連接。在色譜柱管的上下兩端要安裝過濾片，過濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料，此燒結(jié)片上的孔徑小于填料顆粒直徑，卻可讓流動相順利通過，并可阻擋流動相中的極小的機械雜質(zhì)以保護色譜柱。

返回2023/2/2柱溫控制以下幾種情況需精確控制柱溫：（1）在一些法定標準分析方法中，要求保留時間具有再現(xiàn)性。（2）必須通過改變柱溫來提高分離效率。（3）對高分子化合物或粘度大的樣品，柱溫必須高于室溫。（4）具有生物活性的生物分子，要求分析時柱溫應低于室溫。（5）對某些組成復雜的樣品，在單一色譜柱不能實現(xiàn)完全分離，需要使用二維色譜技術(shù)，利用柱切換，使兩根色譜柱在不同柱溫下操作，以實現(xiàn)多組分的完全分離。返回2023/2/2柱填充技術(shù)

填充色譜柱的方法，根據(jù)固定相微粒的大小有干法和濕法兩種。微粒大于20μm的可用干法填充，要邊填充邊敲打和震動，要填得均勻扎實。直徑10μm以下的微粒，不能用干法填充，必須采用濕法。干法裝柱與氣相色譜法相似。濕法裝柱又稱等密度勻槳裝填法。

返回2023/2/2濕法裝柱常用對二氧六環(huán)和四氯化碳，或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶劑，根據(jù)固定相的密度不同，采用不同的溶劑比例，配成密度與固定相相似的混合液為勻漿劑。

1-頂替液槽；2-高壓泵；3-壓力表；4-三通閥；5-勻漿罐；6-色譜柱；7-廢液槽返回2023/2/2檢測系統(tǒng)

高效液相色譜檢測器按適用性分為選擇性檢測器和通用型檢測器。

紫外和紫外-可見分光光度檢測器示差折光檢測器熒光檢測器

電化學檢測器

返回2023/2/2紫外和紫外-可見分光光度檢測器

檢測原理：紫外及紫外—可見光吸收光度檢測器相當于一臺吸收光度計，在高效液相色譜儀的流通池內(nèi)樣品的濃度與吸光度的關(guān)系遵循Beer定律：A=log(I0/I)=εbc式中：A為吸光度，I0為入射光強度，I為透射光強度，ε是樣品的摩爾吸光度，b為流通池的光程長度，c為樣品濃度。

2023/2/2示差折光檢測器

檢測器原理：示差折光檢測器是通過連續(xù)監(jiān)測流動相的折光指數(shù)變化來測定樣品的濃度。各種物質(zhì)都具有不同的折射率,溶液的折射率是溶劑(洗脫劑)和溶質(zhì)(待測組分)各自的折射率乘以各自的摩爾濃度之和。設(shè)溶液的折射率為n，則:式中c1和c2為溶劑和溶質(zhì)的摩爾分數(shù)，c1+c2=1；n1和n2為溶劑和溶質(zhì)的折光指數(shù)。2023/2/2

熒光檢測器

檢測原理：當某些溶液受紫外光照射后，能吸收紫外光線而處于不穩(wěn)定的激發(fā)狀態(tài)，緊接著輻射出比紫外光波更長的光線，即熒光。在被測溶質(zhì)濃度較低時，溶質(zhì)受激發(fā)而發(fā)生的熒光強度與被測溶質(zhì)的濃度成正比關(guān)系。2023/2/2儀器結(jié)構(gòu)

高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應；返回2023/2/2電化學檢測器

電化學檢測器是根據(jù)電化學分析方法而設(shè)計的檢測器。主要有兩種類型：一種是根據(jù)溶液的導電性質(zhì)，通過測定流經(jīng)檢測器的離子溶液電導率的大小來測量離子濃度，此類檢測器是高效離子色譜采用的主要檢測器；另一類是根據(jù)化合物在電解池中工作電極上發(fā)生的氧化-還原反應，通過測量電位、電流和電量來確定化合物在溶液中的濃度。

返回2023/2/2§5-3高效液相色譜基本原理表征液相色譜柱填充性能的重要參數(shù)

總孔率、柱壓力降和柱滲透率高效液相色譜塔板理論高效液相色譜的速率理論返回2023/2/2總孔率式中：F—流動相的體積流速，cm3／s；

u—流動相的平均線速，cm/s;r一柱內(nèi)徑的半徑，cm;tM—柱的死時間；

L—柱長，cm；

V—色譜柱的空體積，cm3。

εT表達了色譜柱填料的多孔性能，當使用全多孔硅膠固定相時，εT約為0.85，使用非多孔的玻璃微珠(或硅膠)固定相時，εT約為0.40，可認為是柱中顆粒之間的孔率，用ε表示。返回2023/2/2柱壓力降式中η一流動相的粘度，MPa·s;k0—色譜柱的比滲透系數(shù)；

dp—固定相顆較直徑，μm；

φ—色譜柱的阻抗因子；

P1、P0—色譜柱的入口壓力和出口壓力，MPa。

返回2023/2/2柱滲透率柱滲透率KF

：表示流動相通過柱子的難易程度。在高效液相色譜法中，由于使用液體流動相，其粘度大于氣體流動相，且固定相粒度又小，為保證柱子在較低壓力下正常操作，總希望柱滲透率要大。

返回2023/2/2高效液相色譜的速率理論其中：Cd為填充系數(shù)，為一常數(shù)；Cm是容量因子k的函數(shù)，為一常數(shù)，其值取決于柱直徑、形狀和填充狀況，當柱填充均勻緊密時，其值下降；Csm是與固定相顆粒微孔中被流動相所占據(jù)部分的分數(shù)以及容量因子k有關(guān)，為一常數(shù)；Cs是與容量因子k有關(guān)的常數(shù)；Dm為組分在流動相中的擴散系數(shù)，比氣相擴散系數(shù)小4~5個數(shù)量級；Ds為組分分子在固定液內(nèi)的擴散系數(shù)；返回2023/2/2§5-4高效液相色譜流動相

一、液相色譜的流動相流動相特性流動相類別流動相選