核酸類藥物的生產

第二章天然生物材料的提取制藥

生化藥物概述

氨基酸類藥物的生產

多肽和蛋白質類藥物的生產

核酸類藥物的生產酶類藥物的生產糖類藥物的生產脂類藥物的生產維生素和輔酶類藥物的生產核酸類藥物的生產核酸知識復習核酸藥物的分類核酸類藥物的生產方法核酸類藥物的生產實例核酸類藥物的檢測思考題核酸知識復習核糖（核糖脫氧核糖）核苷嘌呤（腺嘌呤、鳥嘌呤）堿基核酸核苷酸嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNA、RNA）磷酸DNA和RNA是存在于細胞中的正常成分。DNA主要存在于細胞核中，少量（2%）存在于線粒體和葉綠體中；RNA主要存在于細胞質中，少量（10%）存在于核仁、核漿和染色體中。核酸的含量與細胞大小無關，以生長旺盛的組織細胞中含量較多，如動物胰臟、脾臟、胸腺，植物的莖尖、根尖及各種分生組織等。核酸藥物的分類一、具有天然結構的核酸類物質如：DNA、RNA、肌苷、ATP、輔酶A、脫氧核苷酸、肌苷酸等。獲得：微生物發(fā)酵或從生物資源中提取生產。藥理功能：有助于改善機體的物質代謝和能量代謝平衡，加速受損組織的修復，促使機體恢復正常生理功能。著名企業(yè)：珍奧集團、GENTA公司核酸藥物的分類二、天然堿基、核苷、核苷酸的類似物或聚合物如：三氟代胸苷、疊氮胸苷、拉米夫定（嘧啶類）、阿德福韋（嘌呤類）、恩替卡韋（第三代核苷類抗乙肝病毒藥物）等。獲得：由自然結構的核酸類物質通過半合成生產。藥理功能：治療病毒病如乙肝、腫瘤、愛滋病的重要藥物，也是產生干擾素、免疫抑制劑的臨床藥物。核酸類藥物的生產方法（一）核酸類藥物的原材料除病毒外，所有的動植物組織中都含有核酸類物質，包括大分子DNA和RNA、小分子的核苷酸、核苷、堿基等成分，但不同的組織中含量有所不同。動物胸腺中DNA含量較多，是提取DNA的原料；酵母細胞中RNA含量最多，是提取生產RNA的主要原料。核酸類藥物的生產方法（二）DNA和RNA的生產方法1、分離提取核酸的生產一般采用提取法，即從粉碎、破裂的生物組織細胞中通過一定的方法獲取總DNA或總RNA。如需進一步的純化，常用純化方法如柱層析、凝膠電泳和密度梯度超離心。２、人工合成獲取大分子核酸的另一方法是人工合成，即利用化學的方法按照設定的核苷酸順序逐一加入形成核酸?，F(xiàn)已有核酸合成儀，但合成長度還有一定限制，并且該儀器價格昂貴。因此這種方法一般用于研究，不適合生產。核酸類藥物的生產方法（三）核苷酸、核苷及堿基類似物的生產方法酶解法、半合成法、發(fā)酵法1、酶解法生產酵母，從酵母中提取RNA，RNA經青霉菌屬或鏈霉菌屬等微生物產生的酶進行酶解，制成各種核苷酸。2、半合成法微生物發(fā)酵與化學合成并用。3、直接發(fā)酵法采用營養(yǎng)缺陷型菌株或營養(yǎng)缺陷型兼結構類似物抗性菌株來發(fā)酵大量生產目的核苷或核苷酸。核酸類藥物的生產實例（一）DNA的生產技術提取原理在細胞內的核酸通常是與蛋白質形成復合物——核糖核蛋白（RNP）和脫氧核糖核蛋白（DNP），這兩種復合物在不同電解質溶液中的溶解度有較大差異。RNA＋pro.→RNP（核糖核蛋白）DNA＋pro.→DNP（脫氧核糖核蛋白）

0→0.14MNaCl溶液DNP溶解度逐漸降低，RNP的溶解度很大；

0.14M→0.5MNaCl溶液DNP溶解度逐漸增加。在制備DNA時，可利用0.14MNaCl溶液使DNP與RNP分開。由于DNP在濃鹽溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用濃鹽溶液（1～2M）盡量抽提DNP，然后再去除雜蛋白。核酸類藥物的生產實例工藝路線[抽提]豬脾臟[預處理]

冷凍，絞碎

組織漿液[預處理]

0.1MNaCl-0.5M檸檬酸混合液，離心沉淀1.71MNaCl

上清液（DNP）沉淀（DNP）溶解液0.14MNaCl沉淀物白色纖維狀DNA10%NaCl上清液（DNA）氯仿-異戊醇95%乙醇真空干燥核酸類藥物的生產實例（二）RNA的生產1、來源：微生物——酵母通常在細菌中RNA占5～25％，在啤酒酵母中占2.7～15％，在霉菌中占0.7~28%，面包酵母含RNA4.1～7.2％。酵母菌體提取優(yōu)點：（1）收率高；（2）提取容易。核酸類藥物的生產實例２、RNA的提取——等電沉淀法酵母菌體提取液抽提清液RNA粗品RNA精品稀NaOH，提取中和，分離洗滌、干燥pH2.53、工藝過程（1）預處理：壓榨、除水；（2）提?。?.13%NaOH，使細胞壁變性，使核酸從細胞內釋放出來；（3）中和、除菌體；（4）分離：等電點法，調pH2.5，使RNA沉淀下來；（5）洗滌、干燥核酸類藥物的生產實例（三）ATP制備腺嘌呤前體

腺苷AMPATP枯草桿菌160（Smr+Try－+Pur－）微生物或化學轉化微生物枯草桿菌160（Smｒ+tyr－+pur－）菌株，在添加腺嘌呤（由丙二氰化學合成）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可以大量累積腺苷。也可使用發(fā)酵法直接生產ATP，所用菌種是產氨短桿菌ATCC6872。核酸類藥物的生產實例（四）輔酶A的生產TCA，除蛋白新鮮豬肝【絞碎】

肝漿

【水，提取】提取液濾液GAM樹脂GAM-CoACoA濃集液LD-601-CoACoA粉HCl-NaClCoA酸化液HCl，酸化LD-601，再吸附酸化濃縮液濃縮上清液沉淀物丙酮沉淀脫水干燥核酸類藥物的檢測1、DNA含量測定

DNA是磷酸和戊糖通過磷酸二酯鍵形成的長鏈，所以磷酸或戊糖的量正比例于DNA的量，可通過測定磷酸或戊糖的量來測定DNA的量，前者稱為定磷法，后者稱為定糖法。（1）定磷法磷酸與鉬酸反應生成磷鉬酸，再轉變?yōu)殂f藍，吸收峰在660nm。（2）定糖法——二苯胺法酸性條件下，DNA與二苯胺共熱，生成藍色化合物，吸收峰595nm。核酸類藥物的檢測2、RNA含量測定（1）定磷法——660nm；（2）定糖法——地衣二酚（苔黑酚）法。鹽酸水解RNA，使核糖游離出來，并生成糠醛，與地衣二酚反應呈藍綠色，在670nm處有最大吸收峰。3、核苷酸、核苷含量的測定——紫外分光光度法它們都有特殊的紫外吸收曲線，選取合適的波長，可以根據(jù)其吸收值測定核苷、核苷酸的含量。思考題核酸類藥物的種類和藥理功能是什么？DNA、RNA、ATP及HS-CoA的生產方法。如何檢測核酸類藥物？核苷酸組分腺嘌呤