電泳法和高效毛細管電泳法

第10章電泳法和高效毛細管電泳法

(ElectrophoresisandHighPerformanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)毛細管電泳是帶電粒子在電場力的驅(qū)動下，在毛細管中按其淌度或分配系數(shù)不同進行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細管電泳。20世紀30－40年代蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術(shù)獲得1948年諾貝爾化學獎

1981,實驗上和理論上為毛細管電泳的發(fā)展奠定了基礎。

毛細管電泳的原理

1裝置

毛細管數(shù)據(jù)處理電極檢測器電極試樣緩沖液緩沖液

高壓電源

（可高至30KV）

第10章電泳法和高效毛細管電

分離模式1毛細管區(qū)帶電泳2膠束電動毛細管色譜3毛細管凝膠電泳

4親和毛細管電泳5毛細管電色譜6毛細管等電聚焦電泳7毛細管等速電泳第10章毛細管電泳分離模式

1毛細管區(qū)帶電泳（CZE）

也稱為毛細管自由溶液區(qū)帶電泳毛細管電泳中最基本的操作模式，應用最廣泛，是其它各種操作模式的母體

第10章毛細管電泳分離模式

2膠束電動毛細管色譜膠束電動毛細管色譜:是以電滲流驅(qū)動的一種色譜技術(shù)膠束電動毛細管色譜MECC:是以膠束為假固定相的一種電動色譜，是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)的結(jié)合加入高于膠束臨界濃度的表面活性劑膠束電動色譜的應用特點:使毛細管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.比高效液相色譜更為高效.HPLC分離柱效為5000－25000理論板數(shù)/mMECC可達到50000－500000理論板數(shù)/m比高效液相色譜更為高速.MECC分離時間通常小于30min，但達到相仿效率的毛細管LC，需要更長的時間。

第10章毛細管電泳

分離模式

第10章毛細管電泳分離模式

3毛細管凝膠電泳CGE

是毛細管自由溶液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式

用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，按分子的大小分離

毛細管凝膠電泳的特點：綜合了電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的優(yōu)點，電泳峰尖銳，柱效極高短柱上實現(xiàn)極好的分離試樣容量為10－12g主要缺點:制備柱較困難，壽命較短

已成為分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、DNA等強有力的工具。例應用CGE分離與激光誘導熒光檢測相結(jié)合，用于DNA序列快速分析。第10章毛細管電泳分離模式

第10章毛細管電泳分離模式

5毛細管電色譜CEC:以電滲流驅(qū)動流動相，開管和填充兩種，通常填充或涂布固定相比高效液相色譜具有更高的柱效

第10章毛細管電泳分離模式

6毛細管等電聚焦CIEF:建立在不同蛋白質(zhì)或多肽之間等電點（pI值）差異基礎上的分離方法，通過建立pH值梯度。蛋白質(zhì)的等電點(pI):指蛋白質(zhì)分子的表觀電荷數(shù)為零時的pH值。

進樣－等電聚焦－檢測先將脫鹽的試樣（蛋白質(zhì)）以≥1％的濃度與兩性電解質(zhì)溶液混合，用壓力進樣充入毛細管柱(陽極端)，置于陽極電解質(zhì)溶液如H3PO4中，檢測端為陰極端，置于陰極電解質(zhì)如NaOH中。施加電壓，進行電泳實驗。兩性電解質(zhì)離子形成pH的位置梯度，而蛋白質(zhì)在遷移時會在其等電點的pH區(qū)域內(nèi)停止移動。這樣pI不同的蛋白質(zhì)各組分會在毛細管內(nèi)很窄的不同pH區(qū)域內(nèi)聚焦.在陽、陰極電解液中加入鹽如NaCl或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質(zhì)重新帶電，在電場力作用下發(fā)生遷移、檢測，使不同組分的蛋白質(zhì)得到分離。第10章毛細管電泳分離模式

毛細管等電聚焦的實驗方法:

毛細管等電聚焦特點:等電聚焦實際上也是一個試樣濃縮過程，這一過程可用于濃縮試樣組分。具有極高的分辯率，可以分離等電點相差0.01pH的兩種蛋白質(zhì).注意:電滲流的存在會破壞聚焦區(qū)帶的穩(wěn)定

第10章毛細管電泳分離模式

第10章毛細管電泳分離模式

7毛細管等速電泳分離是建立在試樣中各組分的電泳淌度不同，等速電泳中被分析試樣進樣前后分別使用前導電解質(zhì)溶液和終結(jié)(后繼）電解質(zhì)溶液，分離后的各組分區(qū)帶以相同的電泳遷移速度通過檢測窗口。等速電泳所要求的條件:

1.特殊的電解質(zhì)系統(tǒng):

在毛細管等速電泳中,用有效淌度比樣品中任何離子的有效淌度都大,并具有一定緩沖能力的離子作為前導電解質(zhì)(leadingelectrolyte),加入到末端(檢測端)電解槽和毛細管中,用有效淌度比樣品中任何離子的有效淌度都小,并具有一定緩沖能力的離子作為尾隨電解質(zhì)(terminatingelectrolyte)

加入起始端電解槽中.樣品加在前導電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)之間.系統(tǒng)中要加入對離子,以滿足電中性的要求.區(qū)帶電泳和等速電泳使用的電解質(zhì)溶液的不同在區(qū)帶電泳中，整個系統(tǒng)都用同一種電解質(zhì)充滿，這種電解質(zhì)被稱為背景電解質(zhì)或支持電解質(zhì)。它運載電流并有一定的緩沖能力。在等速電泳中，不加入這樣的背景電解質(zhì)。

2.背景電流要小到足以克服區(qū)帶電泳效應

在毛細管等速電泳中,由于沒有一個背景電解質(zhì)支持電流(毛細管等速電泳要求溶劑的自身電導可以忽略不計),各區(qū)帶互相連接.

毛細管等速電泳一般用恒流操作模式.

分離開始后,在電壓的作用下,各組分由于淌度的不同被分離.

系統(tǒng)通電后,樣品中遷移速度最大的離子運動最快,但慢于前導電解質(zhì).遷移速度最小的離子運動最慢,但快于尾隨電解質(zhì),具有不同淌度的離子得到分離。

恒穩(wěn)態(tài)時所有區(qū)帶具有相同的移動速度.第10章毛細管電泳

10.2.3理論效率及表示方法

1.理論塔板高

H=L/N

N=5.54(tR/W?)2實驗上可按上式求出理論塔板數(shù)W?為電泳峰的半峰寬

2.分離度（Rs），1毛細管電泳系統(tǒng)：高壓電源（可高至30KV）毛細管數(shù)據(jù)處理檢測器電極電極緩沖液試樣緩沖液基本結(jié)構(gòu)：高壓電源、電解液槽和進樣系統(tǒng)、毛細管及恒溫裝置、檢測器、數(shù)據(jù)處理裝置10.3電泳儀和高效毛細管電泳儀⑴高壓電源:0-30kv連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源

⑵毛細管柱：內(nèi)徑25-75μm,常用50和75μm

材料：石英為主，長度30-70cm,

凝膠柱20cm左右?；窘Y(jié)構(gòu)：（3）進樣方法Ⅰ電動力學進樣也稱電遷移進樣.樣品方法:將毛細管的進樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測端的緩沖液間施加進樣電壓，并維持一定時間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進入毛細管，然后再將試樣溶液換成載體緩沖液，電泳即可進行。電極電極樣品壓力樣品真空樣品虹吸Ⅱ流體動力學進樣A進樣端加壓B檢測端出口減壓C虹吸進樣流體動力學進樣優(yōu)點：1.若嚴格控制樣品的黏度和溫度，則進入毛細管的量是固定的；2.在進樣中沒有進樣歧視。ABC(4)檢測器檢測器檢出限（mol/L）特點UV－可見吸收10-5－10-6

近似通用，常規(guī)應用熒光非相干光誘導10-7－10-8

靈敏，但試樣通常要衍生激光誘導10-10－10-12

高靈敏度，價格貴，要衍生化電化學

電導10-5－10-7

通用性安培10-8－10-9

選擇性，靈敏度高，微量質(zhì)譜10-7－10-9

儀器復雜，可獲結(jié)構(gòu)信息，質(zhì)量靈敏度高放射10-9－10-11

靈敏度高，操作有特殊要求(4)檢測器檢測器檢出限（mol/L）特點UV－可見吸收10-5－10-6

近似通用，常規(guī)應用熒光非相干光誘導10-7－10-8

靈敏，但試樣通常要衍生激光誘導10-10－10-12

高靈敏度，價格貴，要衍生化電化學

電導10-5－10-7

通用性安培10-8－10-9

選擇性，靈敏度高，微量質(zhì)譜10-7－10-9

儀器復雜，可獲結(jié)構(gòu)信息，質(zhì)量靈敏度高放射10-9－10-11

靈敏度高，操作