GB/T 19200-2003豬水泡病診斷技術(shù)

ICS11.220B41中華人民共和國國家標準GB/T19200—2003豬水泡病診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforswinevesiculardisease2003-06-17發(fā)布2003-12-01實施中華人民共和國發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局

GB/T19200—2003前豬水泡?。⊿wineVesicularDisease,簡稱SVD)是豬的一種烈性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織CWorldOrganizationforAnimalHealth(英）.OfficeInternationaldesEpizooties（法）.OIE列為A類疾病.我國將其列為一類動物疫病。本病主要在豬的蹄睡、蹄冠、唇、舌、鼻及乳頭部引起水泡.臨床癥狀與豬口蹄疫(FootandMouthDisease.簡稱FMD)相似。本標準提出的實驗室方法主要是以世界動物衛(wèi)生組織(OIE)《哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊》為依據(jù).并結(jié)合我國實際情況制定，其中“豬水泡病反向間接血凝試驗”是我國建立的方法。本標準的附錄八、附錄B、附錄C、附錄D、附錄E均為規(guī)范性附錄。附錄F為資料性附錄。本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術(shù)委員會歸口。本標準起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所本標準主要起草人：張永光、牟克斌、王永錄、劉西蘭、方玉珍。

GB/T19200—2003豬水泡病診斷技術(shù)范圍本標準規(guī)定了豬水泡病病毒分離及鑒定，反向間接血凝試驗（RIHA)瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID)和病毒中和試驗（VN)的技術(shù)要求。本標準適用于豬水泡病的診斷。反向間接血凝試驗和瓊脂凝膠免疫擴散試驗適用于大批樣品篩選試驗·包括產(chǎn)地檢疫、疫情監(jiān)測、流行病學調(diào)查和無本病健康豬群的建立：病毒中和試驗（VN)適用于診斷和進出口豬檢疫及抗體水平的評估。2病毒分離及鑒定2.1材料準備2.1.1滅菌注射器，研缽2.1.2pH7.6、0.05mol/L的磷酸緩沖液（PB).pH7.6.50%的丙三醇礁酸緩沖液(GPB)·pH7.2、0.11mol/L的磷酸緩沖液(PB),配制方法見附錄A。2.1.3仔豬腎傳代細胞（IB-RS-2).乳鼠2.1.4細胞培養(yǎng)液，見附錄B.2.2樣品的采集及處理2.2.1水泡液：將水泡表面用75%酒精棉球消毒，用注射器抽取水泡液,直接放入滅菌小瓶中，加蓋封口，避光送至實驗室，不做處理直接用于檢測。2.2.2水泡皮:采集鼻鏡、蹄部新鮮水泡皮·采集量為0.5g以上·放入預先加有pH7.6、50%的GPB的滅菌瓶中，加蓋封口.送至實驗室。2.3細胞分離2.3.1新鮮水泡液不做任何處理,可直接使用。當IB-RS-2長滿單層細胞后.棄去培養(yǎng)液，加入水泡液·以能沒細胞單層為宜，于37℃感作30min,然后補加4倍于水泡液的細胞培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)每天在倒置顯微鏡下觀察2次.48h終判,若細胞培養(yǎng)液對照孔成立，分離病毒的細胞孔細胞出現(xiàn)變圓乃至脫落,則視為細胞病變(CPE)判為陽性·若48h不出現(xiàn)CPE,則應凍融2次，再育傳3代.不出現(xiàn)CPE.判為陰性，出現(xiàn)CPE.則需做進一步鑒定。2.3.2水泡皮的分離.將水泡皮用pH7.2、0.11mol/LPB洗2次～3次.用滅菌濾紙吸去水分.稱其質(zhì)量后置于加少量石英砂或玻璃砂的研缽中，按質(zhì)量體積比(1：2)～（1：5)加入pH7.2、0.11mol/LPB研磨;制成懸液，室溫浸毒1h或4C12h,以3000r/min離心20min～30min,取上清液用于病毒分離。2.4乳鼠分離2.4.1乳鼠為2～3日齡小鼠，每份材料接種4只小鼠，每只頸背部皮下接種0.1mL～0.2mL.在母鼠哺乳下觀察5天。2.4.2若5天內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀乃至死亡.剝皮去頭及內(nèi)臟,將肌肉及骨胎一起稱量，按質(zhì)量體