實(shí)時(shí)熒光定量

實(shí)時(shí)熒光定量第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日內(nèi)容Real-timePCR原理Real-timePCR用途Real-timePCR實(shí)驗(yàn)第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日PCR原理常規(guī)PCR：擴(kuò)增DNA，借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析變性退火延伸Y0×2×4×8×16……Y0×2n第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日實(shí)時(shí)熒光定量PCR:擴(kuò)增DNA，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對(duì)起始模板的定量分析Real-timePCR原理Y0×2×4×8×16……Y0×2n擴(kuò)增曲線背景期對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期線性增長(zhǎng)期平臺(tái)期第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日熒光嵌合法（非特異性）SYBRGreenI熒光探針法（特異性）TaqManprobeCyclingprobe……RealTimePCR的熒光化學(xué)檢測(cè)原理第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日非特異性的熒光嵌合法——

SYBRGreenI

SYBRGreenI是一種能夠結(jié)合于所有雙鏈DNA小溝中的熒光染料，SYBR與PCR合成DNA雙鏈結(jié)合后，發(fā)射熒光信號(hào)，而游離的SYBR不會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)，因此熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，成本較低缺點(diǎn)：與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，不能進(jìn)行多重PCR適用：不同樣本同一基因相對(duì)表達(dá)量分析第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日特異性熒光探針法——TaqManprobeTaqman探針是一段與目的基因配對(duì)的DNA序列，5‘端加熒光物質(zhì)，3‘端加淬滅物質(zhì)，完整探針5‘端的熒光物質(zhì)被3‘端淬滅物質(zhì)抑制，不發(fā)熒光，當(dāng)PCR合成DNA，退火時(shí)探針和DNA配對(duì)，延伸時(shí)，由于DNA聚合酶也有核酸外切酶活性，將探針分解，5‘端熒光物質(zhì)游離出來，發(fā)出熒光，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，表征PCR擴(kuò)增的DNA量。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，能進(jìn)行多重PCR缺點(diǎn)：需設(shè)計(jì)特異性探針，成本較高適用：區(qū)別同源性高的序列，SNP解析等多重PCR檢測(cè)第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日重要術(shù)語:閾值（Threshold）：在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定的熒光檢出界限（第3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍）C(t)值（Cycleofthreshold）：熒光信號(hào)（擴(kuò)增產(chǎn)物）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)閾值C(t)值

18.12+/-0.0418.12+/-0.0418.12+/-0.04C(t)值18.12+/-0.04RealTimePCR的數(shù)學(xué)定量原理第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日絕對(duì)定量相對(duì)定量RealTimePCR的數(shù)學(xué)定量原理初始DNA量越多，越早達(dá)到閾值，擴(kuò)增曲線越早起峰，Ct值越小經(jīng)數(shù)學(xué)理論證明，初始DNA量的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)/Ct呈反比線性關(guān)系腫瘤正常第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日絕對(duì)定量將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行RealTimePCR,會(huì)得到一系列等間隔的擴(kuò)增曲線。以它們的Ct值作橫坐標(biāo)，初始DNA量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知濃度的樣品進(jìn)行RealTimePCR,得到Ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以樣品的初始DNA量。10410310610510210熒光強(qiáng)度---循環(huán)數(shù)曲線初始DNA量對(duì)數(shù)---Ct循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定初始DNA/RNA基因拷貝數(shù)或濃度，通常用于病毒，病原菌的定量檢測(cè)即轉(zhuǎn)基因食品食品的檢測(cè)。第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日相對(duì)定量比較不同樣本之間基因表達(dá)量的高低變化，需要做相對(duì)定量。相對(duì)定量引入內(nèi)參基因，即維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必需的基因，其表達(dá)量在不同的細(xì)胞里基本一樣，在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參基因，用不同樣本的目的基因的擴(kuò)增量與各自內(nèi)參基因的擴(kuò)增量的比值對(duì)目的基因表達(dá)量進(jìn)行均一化后，再比較高低，可以對(duì)不同樣本間細(xì)胞起始數(shù)，RNA提取效率，基因擴(kuò)增效率的不同進(jìn)行矯正。第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日Real-timePCR用途定性分析:病毒和病原菌檢測(cè);單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè);物種鑒定定量分析:絕對(duì)定量:病毒和病原菌定量;基因拷貝數(shù)分析;轉(zhuǎn)基因定量分析相對(duì)定量:基因表達(dá)量分析基因表達(dá)的中心法則第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日Real-timePCR實(shí)驗(yàn)

——以癌細(xì)胞藥物處理后不同時(shí)間點(diǎn)某基因表達(dá)量的變化為例SYBRgreen1的相對(duì)定量法：一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，材料處理，取材凍存二、目的和內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計(jì)三、準(zhǔn)備試劑與耗材，預(yù)約儀器四、RNA提取，質(zhì)量與濃度檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA五、按反應(yīng)體系準(zhǔn)備樣品六、上機(jī)設(shè)定反應(yīng)條件，運(yùn)行程序進(jìn)行反應(yīng)七、溶解曲線分析熒光信號(hào)產(chǎn)生的特異性八、獲得數(shù)據(jù)，計(jì)算分析結(jié)果并做圖第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日對(duì)照組Control處理組Drug112h重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)30h3h6h12h重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)33h6h一實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，材料處理，取材凍存（-80℃）菌檢健康的癌細(xì)胞對(duì)照組處理組0h#1#2#33h#4#5#6#7#8#96h#10#11#12#13#14#1512h#16#17#18#19#20#21第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日二目的和內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計(jì)目的基因的選擇：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?nèi)參基因的選擇：維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必需的基因，如GAPDH，Actin，18SrRNA等通過查文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)篩選第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：引物設(shè)計(jì)軟件Oligo7第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日三、準(zhǔn)備試劑，耗材，預(yù)約儀器試劑：RNA提取試劑盒，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（≥21次反應(yīng)），SYBRmix（≥21×2次反應(yīng)）等耗材：槍頭，EP管等（無RNase處理），96/384孔版，透明薄膜，冰及冰盒等儀器：槍，離心機(jī)，Nanodrop核酸濃度測(cè)定儀，核酸電泳儀，熒光定量PCR儀等第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日四、RNA提取，質(zhì)量與濃度檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA針對(duì)樣品選用一款合適的RNA提取試劑盒取相同量的組織或細(xì)胞提取總RNA提取的總RNA?；煊谢蚪MDNA，可以通過DNase處理去除或跨內(nèi)含子引物設(shè)計(jì)避免基因組DNA擴(kuò)增RNA電泳檢測(cè)降解情況Nanodrop測(cè)定RNA濃度和純度（OD260/280≥2，OD260/230≥2）取相同量的RNA（如1ug）做反轉(zhuǎn)錄RNA易降解，而cDNA可于-20℃保存很久第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日五、按反應(yīng)體系準(zhǔn)備樣品上述cDNA需要進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)摸索（使內(nèi)參Ct約20）每個(gè)樣品做2個(gè)技術(shù)重復(fù)，事先設(shè)計(jì)好樣品在96孔板上的排列先把稀釋好的cDNA加到96孔板，再加混好的SYBRmixture,primer,H2O加入96孔板，蓋上透明薄膜，離心后上機(jī)反應(yīng)體系：內(nèi)參×42目的×42TemplatecDNA4uL2×SYBRmixture10uL420uL420uLForwardprimer0.5uL21uL21uLReverseprimer0.5uL21uL21uLH205uL220uL220uLTotal20uL內(nèi)參目的112233445566778899101011111212131314141515161617171818191920202121112233445566778899101011111212131314141515161617171818191920202121第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日六、上機(jī)設(shè)定反應(yīng)條件，運(yùn)行程序進(jìn)行反應(yīng)參考SYBRgreen1Kit的說明書預(yù)變性：95℃,30s,20℃/s——1cyclePCR反應(yīng)：95℃,5s,20℃/s60℃,20s,20℃/s——40Cycles溶解曲線分析：95℃,

0s,20℃/s72℃,

15s,20℃/s95℃,

0s,0.3℃/s第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日七、從溶解曲線確認(rèn)PCR反應(yīng)的特異性溶解曲線的一次曲線溶解曲線的負(fù)一次曲線微分曲線PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物呈雙鏈，具有較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度，此時(shí)，將PCR反應(yīng)液的溫度漸漸升高，DNA雙鏈漸漸打開，嵌入DNA雙鏈中的SYBRGreen數(shù)量減少，熒光信號(hào)強(qiáng)度漸漸降低，當(dāng)雙鏈DNA解鏈一半時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度急劇下降，此時(shí)的溫度即溶解溫度（Tm值），對(duì)于某一特定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其值是固定的。第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日八、獲得數(shù)據(jù)，計(jì)算分析結(jié)果并做圖樣品內(nèi)參Ct目的Ct相對(duì)表達(dá)量120.15120.12220.13220.14319.88319.99420.45420.21519.45519.70………………Power(內(nèi)參Ct-目的Ct，2)第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日謝謝關(guān)注，歡迎交流討論！第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR原理常規(guī)PCR：擴(kuò)增DNA，借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日常規(guī)PK實(shí)時(shí)PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

常規(guī)PCR能進(jìn)行定量或定性分析靈敏度高，精確度高不需要電泳分析，省時(shí)，安全，不易污染需要熒光定量PCR儀，熒光染料等，成本較高只能進(jìn)行半定量或定性分析靈敏度低，精確度低需要電泳分析，費(fèi)時(shí)，不安全，易污染只需要普通PCR儀與PCR試劑，成本較低第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日各種熒光檢測(cè)方法比較SYBRgreentaqmanCycling優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日RealTimePCR定量的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：Yn=Y0×2n非理想的PCR反應(yīng)：Yn=Y0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: logYn=log［Y0(1+Ex)n］整理方程式得: logY0=［-log(1+Ex)］×n+logYn將Ct和YCt帶入上式得：

logY0=［-log(1+Ex)］×Ct+logYCtn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Yn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量Y0：初始DNA量Ex：擴(kuò)增效率初始DNA量的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)/Ct呈反比線性關(guān)系第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日Real-timePCR用途定性分析定量分析絕對(duì)定量相對(duì)定量病毒和病原菌檢