實驗七聚合酶鏈式反應(yīng)多態(tài)性

實驗七聚合酶鏈式反應(yīng)多態(tài)性第一頁，共二十一頁，2022年，8月28日一、實驗?zāi)康暮鸵笸ㄟ^本實驗學習和掌握PCR基因擴增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因擴增技術(shù)在DNA操作中的重要性。

第二頁，共二十一頁，2022年，8月28日

PCR用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。每個循環(huán)包個三個步驟，即，首先加熱到94

-95℃使模板DNA變性,接著將反應(yīng)液冷卻到某一溫度,使引物與它的靶序列發(fā)生退火,此后,退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反復(fù)進行變性、退火和延伸這一循環(huán)。由于一輪擴增產(chǎn)物又充當下一輪擴增的模板，所以每完成一個循環(huán)，就使目的DNA產(chǎn)物增加一倍。二、實驗原理第三頁，共二十一頁，2022年，8月28日第四頁，共二十一頁，2022年，8月28日PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成主要包括：模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、緩沖液。第五頁，共二十一頁，2022年，8月28日

要擴增模板DNA，首先要設(shè)計兩條引物,實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5’端決定擴增產(chǎn)物的兩個5’末端位置。由于引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，因此，引物設(shè)計也就更為重要。引

物：第六頁，共二十一頁，2022年，8月28日

引物在PCR反應(yīng)中的濃度一般在0.1～1μM之間。濃度過高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來說用低濃度引物經(jīng)濟、特異，但濃度過低，不足以完成30個循環(huán)的擴增反應(yīng)，則會降低PCR的產(chǎn)率。第七頁，共二十一頁，2022年，8月28日dNTP（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）在PCR反體系中dNTP終濃度高于50mM會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。PCR常用的濃度為50～200μM，不能低于10～15μM。四種dNTP的濃度應(yīng)相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導(dǎo)聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應(yīng)。第八頁，共二十一頁，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶:TaqDNA聚合酶最早是從嗜熱水生菌中提純出來的。典型PCR反應(yīng)混合物中，常用范圍為1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，TaqDNA聚合酶的用量亦有差異，酶量過多會導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。第九頁，共二十一頁，2022年，8月28日模板模板的種類：單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA對于模板的用量:

基因組DNA：50-100ng質(zhì)粒DNA:5-10ng第十頁，共二十一頁，2022年，8月28日PCR緩沖液:

用于PCR的標準緩沖液為10～50mM的Tris–HCl緩沖液（pH8.3）和1.5mMMgCl2。第十一頁，共二十一頁，2022年，8月28日PCR循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR循環(huán)次數(shù)一般為25～40個周期。一般是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴重，復(fù)雜度增加。當然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。第十二頁，共二十一頁，2022年，8月28日PCR擴增過程

在微量離心管中加入適量緩沖液、微量模板DNA、四種脫氧單核苷酸（dNTP）和耐熱Taq聚合酶及兩個合成DNA引物，并有Mg2+存在。第十三頁，共二十一頁，2022年，8月28日(1)變性階段加熱使模板DNA在高溫下（90℃-95）變性，雙鏈解鏈；(2)退火階段降低溶液溫度，使合成引物在低溫（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），與模板DNA互補退火形成部分雙鏈；(3)延伸階段溶液反應(yīng)溫度升至中溫(72℃)，在Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈。第十四頁，共二十一頁，2022年，8月28日三.實驗儀器及材料PCR儀、臺式離心機、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)等TaKaRaTaq(5U/l)10×PCRBuffer(Mg2+Plus)dNTPMixture(each2.5mM)模板DNA引物（10M)第十五頁，共二十一頁，2022年，8月28日1、設(shè)計PCR反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性5min94℃1min55℃1min45cycles72℃2min72℃10min4℃冷卻恒定。四、實驗步驟第十六頁，共二十一頁，2022年，8月28日2、在0.2ml薄壁管中，依次加入以下各成分:ddH2O:

12.5l

10×buffer（Mg2+）:2ldNTPs(2.5mM)

2l

primer(10M)

:2lTaqDNApolymerase(5U/l)

:0.5l

DNA(10ng/l):1l總體積20l第十七頁，共二十一頁，2022年，8月28日3、混勻后，離心2-3秒，將PCR薄壁管放入PCR儀的樣品槽中，按START鍵，啟動PCR儀。第十八頁，共二十一頁，2022年，8月28日采