實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)和沉淀反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)和沉淀反應(yīng)第一頁，共十五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)原理

蛋白質(zhì)分子中的某種或某些基團(tuán)與顯色劑作用，可產(chǎn)生特定的顏色反應(yīng)。不同蛋白質(zhì)所含氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦可不同。顏色反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)，一些非蛋白物質(zhì)亦可產(chǎn)生相同的顏色反應(yīng)，因此不能僅根據(jù)顏色反應(yīng)的結(jié)果決定被測(cè)物是否是蛋白質(zhì)。顏色反應(yīng)是一些常用的蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。第二頁，共十五頁，2022年，8月28日常見的蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)

米倫氏反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)

黃色反應(yīng)

茚三酮反應(yīng)

乙醛酸反應(yīng)

第三頁，共十五頁，2022年，8月28日（一）米倫氏（Millon）反應(yīng)

原理：米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞和亞硝酸汞之混合物，能與苯酚、雙酚及某些羥苯衍生物產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這些反應(yīng)最初產(chǎn)生的有色物質(zhì)可能為羥苯之亞硝基衍生物，經(jīng)變位作用變成顏色更深的鄰醌肟，最終形成紅色穩(wěn)定產(chǎn)物。組成蛋白質(zhì)的氨基酸中只有酪氨酸為羥苯衍生物，因此該反應(yīng)為酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）。

注意事項(xiàng)：加熱時(shí)容易產(chǎn)生暴沸，要注意安全，應(yīng)溫和加熱。第四頁，共十五頁，2022年，8月28日（二）雙縮脲反應(yīng)

原理：將尿素加熱，兩分子尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紅紫色的絡(luò)合物，此反應(yīng)為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，故能呈此反應(yīng)。一般肽鍵越多顏色越深，而且受蛋白質(zhì)特異性影響小注意事項(xiàng)：硫酸銅不能多加，否則會(huì)產(chǎn)生影響觀察的藍(lán)色絡(luò)離子Cu(NH3)42+第五頁，共十五頁，2022年，8月28日（三）黃色反應(yīng)

原理：蛋白質(zhì)分子中含有苯核結(jié)構(gòu)的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），遇到硝酸可硝化成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)在堿性環(huán)境中變?yōu)殚冱S色的硝苯衍生物。這是含酪氨酸和色氨酸蛋白質(zhì)所特有的反應(yīng)。皮膚、指甲和毛發(fā)等遇濃硝酸變黃，原因在此。（四）茚三酮反應(yīng)

原理：蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，則產(chǎn)生藍(lán)色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)及－氨基酸所共有。注意事項(xiàng)：反應(yīng)必須在pH5-7進(jìn)行。第六頁，共十五頁，2022年，8月28日（五）乙醛酸反應(yīng)

含色氨酸的蛋白質(zhì)在濃硫酸中與一些醛類反應(yīng)能形成有色物質(zhì)。此反應(yīng)可作為色氨酸的定性定量反應(yīng)。１、在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成２、色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）３、鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸實(shí)驗(yàn)步驟第七頁，共十五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)原理

在水溶液中蛋白質(zhì)分子的表面由于形成水化層和雙電層，而成為穩(wěn)定的膠體顆粒。但這種穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。在一定的物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷，脫水，甚至變性而喪失穩(wěn)定因素，即以固態(tài)形式從溶液中析出，這種作用稱為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。

可逆沉淀反應(yīng)：在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)。除去沉淀因素后，蛋白質(zhì)沉淀可再溶于原來的溶劑中。

不可逆沉淀反應(yīng)：在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，特別是天然結(jié)構(gòu)遭到破壞，失去其天然蛋白質(zhì)的原來性質(zhì)，這種蛋白質(zhì)沉淀不能再溶解于原來的溶劑中。第八頁，共十五頁，2022年，8月28日常見的蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)

蛋白質(zhì)鹽析作用酒精沉淀蛋白質(zhì)重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)無機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)加熱沉淀蛋白質(zhì)第九頁，共十五頁，2022年，8月28日（一）蛋白質(zhì)鹽析作用原理：向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等）至一定濃度，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。沉淀不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽的濃度也不同。

注意事項(xiàng)：１、應(yīng)先加蛋白質(zhì)溶液，然后加飽和硫酸銨溶液；２、固體硫酸銨若加到過飽和則有結(jié)晶析出，勿與蛋白質(zhì)沉淀混淆。（二）酒精沉淀蛋白質(zhì)原理：酒精為脫水劑，能破壞蛋白質(zhì)膠體質(zhì)點(diǎn)的水化層而使其沉淀析出。第十頁，共十五頁，2022年，8月28日（三）重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)原理：當(dāng)溶液PH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，這樣它就容易與重金屬鹽（如Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+等）結(jié)合形成不溶性鹽類而沉淀。注意事項(xiàng)：使用乙酸鉛或硫酸銅沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，試劑不可加過量，否則可使沉淀出的蛋白質(zhì)重新溶解。為什么？（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)原理：植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物稱為生物堿。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。當(dāng)溶液PH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。第十一頁，共十五頁，2022年，8月28日（五）有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)原理：當(dāng)溶液PH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與某些有機(jī)酸如三氯乙酸和磺基水楊酸等的酸根負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。這個(gè)反應(yīng)可將生物體液中的蛋白質(zhì)完全清除。（六）無機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)原理：濃無機(jī)酸（磷酸除外），能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)。這種沉淀作用可能是蛋白質(zhì)顆粒脫水的結(jié)果。第十二頁，共十五頁，2022年，8月28日（七）加熱沉淀蛋白質(zhì)原理：幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，變成不可逆的不溶狀態(tài)。鹽類和氫離子濃度對(duì)蛋白質(zhì)加熱凝固有重要影響。少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)的加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全、最迅速。在酸性或堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子帶有正電荷或負(fù)電荷，雖加熱蛋白質(zhì)也不凝固。若同時(shí)有足量的中性鹽存在，則蛋白質(zhì)可因加熱而凝固。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的原理可能是由于熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時(shí)由于蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)也破壞了帶電狀態(tài)。第十三頁，共十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)中使用的試劑種類繁多，注意防止所使用試劑的交叉污染。注意滴管的正確使用，防止酸、堿或有機(jī)試劑污染滴頭。在實(shí)驗(yàn)中，特別是酒精燈加熱過程中要注意操作規(guī)范，注意實(shí)驗(yàn)安全.雙縮脲反應(yīng)時(shí)試管