實驗四SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量

實驗四SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日一、實驗目的學習SDS測定蛋白質分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。運用SDS測定蛋白質分子量及染色鑒定。第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日

二、實驗原理帶電質點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質上加一個點或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質上或支持介質中遷移。支持介質的作用：防止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對流。第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應單體：丙烯酰胺（Acr）交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）催化劑：過硫酸胺加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結構的凝膠第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日PAGE根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應分離。不連續(xù)電泳系統(tǒng)中緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度具有不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，所分離條帶清晰度及分辨率較好。第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠層由濃度不同的兩層凝膠組成：上層凝膠濃度較低（3％），為大孔徑的濃縮膠，凝膠對溶質的泳動無阻滯作用，溶質在此層得到濃縮；下層凝膠濃度較高（5-25％），為小孔徑的分離膠，各個組分根據(jù)遷移率的差別分離。當?shù)鞍踪|的pI小于8-9.5時，一般電極緩沖液采用pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8的Tris-HCl緩沖液，分離膠為pH8.8的Tris-HCl緩沖液。在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應，即樣品的濃縮效應，凝膠的分子篩效應和電荷效應，由于這三種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。8.38.38.96.7－＋第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基磺酸鈉）。SDS與蛋白質結合后引起蛋白質構象的改變。SDS-蛋白質復合物的形狀近似于長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，而長軸則隨蛋白質相對分子質量成正比變化。當SDS與蛋白質結合后，蛋白質分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超越其原來的電荷，使蛋白質分子間的電荷差別降低乃至消除。SDS-蛋白質復合物在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，只是蛋白質相對分子質量的函數(shù)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：lgMW=K-bX

式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日

15%15-45Kd12.5%15-60Kd10%18-75Kd7.5%30-120Kd5%60-210Kd

聚丙烯酰胺濃度越高，凝膠孔徑越小，適合分離的溶質的相對分子質量越小。不同濃度聚丙烯酰胺分離膠分離蛋白質范圍第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白質分子量時，只有完全打開二硫鍵，蛋白質分子才能被解聚，SDS才能定量地結合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關系。因此在用SDS處理樣品同時往往用巰基乙醇處理，使被還原的二硫鍵不易再氧化，使很多不溶性蛋白質溶解而與SDS定量結合。有許多蛋白質是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質不能用SDS測定分子量。如電荷異常或構象異常的蛋白質，帶有較大輔基的蛋白質（某些糖蛋白）以及一些結構蛋白，如膠原蛋白等。一般至少采用兩種方法測定未知樣品分子量，互相驗證。第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日三.實驗試劑和器材

1.材料

低分子量標準蛋白試劑盒

低分子量標準蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000

胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

根據(jù)說明書處理標準蛋白。

第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日2.實驗試劑（1）30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr29g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）1g，

加蒸餾水至100mL，過濾后置棕色瓶中，4℃貯存可用1-2月。

（2）1.5mol/LTris-HCl緩沖液，pH8.8

：稱取Tris18.2g，加入

50mL水，用50％鹽酸調pH8.8，最后用蒸餾水定容至100mL。

（3）1.0mol/LTris-HCl緩沖液，pH6.8：稱取Tris12.1g，加入50mL

水，用50％鹽酸調pH6.8，最后用蒸餾水定容至100mL。

（4）10%SDS（十二烷基磺酸鈉）。

（5）10%過硫酸銨（AP）：稱取0.1g過硫酸銨，加入1mL水溶解。

（6）TEMED（四甲基乙二胺）

第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日（7）2×SDS上樣緩沖液：0.4gSDS，20mg溴酚藍，2mL甘油，1mL1MTris-HCl（pH8.0），20μL巰基乙醇，定容至10mL。（8）SDS電泳緩沖液（25mMTris，0.25M甘氨酸，0.1%SDS，

pH8.3）：稱Tris3.02g，甘氨酸18.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1L。（9）染色液：稱考馬斯亮藍R2500.25g，溶于227mL蒸餾水，227mL甲醇，46mL冰醋酸的混合液中，過濾后備用。（10）脫色液：冰乙酸100ml，乙醇50ml，加蒸餾水850mL，混勻?？捡R斯亮藍染色法所用試劑第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日（11）銀染固定液。10%冰乙酸溶液。（12）銀染溶液。0.1%硝酸銀溶液100mL，使用前加37%甲醛0.5mL。（13）顯影液。3%碳酸鈉溶液200mL，使用前加硫代硫酸鈉0.8mg和37%甲醛1mL。銀染法所用試劑第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日3.實驗器材垂直板電泳裝置直流穩(wěn)壓電源移液管濾紙微量注射器大培養(yǎng)皿第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日四、實驗要求樣品1：蔗糖酶樣品2：肌酸激酶（從中華鱉肌肉中提?。悠?：牛血清白蛋白樣品4：酪氨酸酶（從雙胞蘑菇中提?。└鶕?jù)老師提供的蛋白質樣品，先查閱資料，按其分子量選擇合適的凝膠濃度進行SDS凝膠電泳，選擇考馬斯亮藍或銀染法進行染色，測定樣品的分子量和純度情況。第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日五.實驗步驟

1.配制SDS聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑2.SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制

1）根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板

2）確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下步操作。第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日3）迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需空間（梳子的齒長再加0.5cm）。再在膠液面上小心注入1mL蒸餾水以阻止氧氣進入凝膠溶液。4）分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水?！獾哪康氖菫榱耸狗蛛x膠上延平直，并隔絕空氣。

※凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日5）制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下步操作。第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日6）聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。7）在等待濃縮膠聚合時，可對樣品進行處理，在樣品中按1:1體積比加入上樣緩沖液，在100℃加熱5分鐘以使蛋白質變性。8）濃縮膠聚合完全后（30分鐘），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液?！逛忼X孔內的氣泡全部排出，否則會影響加樣效果?！鶚邮嵝枰淮纹椒€(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日3.加樣電泳1）按預定順序加樣，加樣量通常為10－25μL（1.5mm厚的膠）。2）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為60V。當染料前沿進入分離膠后，把電壓提高到120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1cm，然后關閉電源。3）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角以標注凝膠的方位?！鶚岊^插入不可過低，以防刺破膠體，也不可過高，在樣品下沉時會擴散。

※為避免邊緣效應，最好選用中部的孔注樣。

※剝膠時要小心，保持膠完好無損。第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日1）用考馬斯亮藍對SDS聚丙烯酰胺凝膠進行染色經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品可用考馬斯亮藍R250染色。染色1小時。2）換脫色液脫色需3～10小時，其間更換多次脫色液至背景清楚。脫色后，對凝膠進行拍照。4.染色方法考馬斯亮藍染色法第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日

要求盡量在低溫下操作，所有溶液提前預冷到4℃，戴手套操作，以免指紋污染。1）把膠放入塑料盒中，加入銀染固定液約3～5倍的體積，沒過凝膠，在搖床上慢速振蕩30min。2）蒸餾水洗膠3次，每次2min。3）轉移凝膠到銀染溶液中，注意：37%甲醛0.5mL在使用前才能加入。搖床上慢速振蕩染色30min。4）轉移凝膠到10℃以下的蒸餾水中振蕩洗滌10sec。銀染法第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日5）快速轉移凝膠到顯影液中，注意：硫代硫酸鈉0.8mg和37%甲醛1mL在使用前才能加入?？焖僬袷幉⒂^察斑帶的出現(xiàn)，若理想結果一出現(xiàn)應及時終止顯影。如果顯影時間過長，凝膠背景顏色變深，影響整體效果。6）終止顯影。把凝膠放回原來的銀染固定液中，中速振蕩5min。7）蒸餾水漂洗最后一次。凝膠成像系統(tǒng)掃描。第二十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日六.計算分析繪制標準曲線：

按下式計算相對遷移率：

蛋白樣品距加樣端距離（cm）

相對遷移率＝溴酚藍區(qū)帶距加樣端距離（cm）

以每個蛋白標準的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量。

注意：這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具