對蝦養(yǎng)殖生物學

對蝦養(yǎng)殖生物學第一頁，共三十八頁，2022年，8月28日WSSV的形態(tài)學WSSV屬線頭病毒科Nimaviridae，完整包膜的病毒體（粒子）長210-380nm，最寬處70-167nm。用負染電鏡觀察，WSSV的病毒體末端具尾狀附器(tail-likeappendage)。膜厚6-7nm，為脂質三層膜結構，由不透明電子層分隔成兩層透明層。核衣殼位于膜內，為彈簧體型結構，由直徑10nm的球形蛋白亞基構成。這些蛋白亞基沿長軸垂直排列成，每22nm就有4-15層，使核殼體呈斜紋格形。核殼體從膜里出來后變長，表明它是緊緊壓縮在病毒體內。各核衣殼規(guī)格各異，長度變化在180-420nm之間，寬在54-85nm之間，具有厚6nm的外壁。

第二頁，共三十八頁，2022年，8月28日無包涵體的桿狀病毒，橫切片為圓形。核衣殼一端鈍圓，另一端為平頭，表面有分段的與與病毒粒子的長軸垂直的15節(jié)花紋結構，為指環(huán)域堆(ring-structure)積形成，每個指環(huán)結構為由一排直徑為10的亞單位。第三頁，共三十八頁，2022年，8月28日第一個被測得的基因組遺傳密碼的海洋生物病毒、目前已測得的最大的動物病毒之一。第四頁，共三十八頁，2022年，8月28日基因組及其分類

環(huán)形雙鏈DNA分子，A+T含量占59%，分布均勻。不同隔離群的基因組大小各異，如中國大陸的WSSV為305kbp，臺灣省的307kbp，泰國的293

kbp。

第五頁，共三十八頁，2022年，8月28日WSSV的結構蛋白有40多種蛋白質，在轉錄調節(jié)病毒增殖和/或DNA復制調節(jié)過程中，還有結構蛋白。WSSV病毒體內至少有38種結構蛋白，其中膜上有21種，核衣殼中有10種，間層膜和核衣殼之間有5種。在膜蛋白VP31、VP110和VP281、間層蛋白VP36A和核衣殼蛋白VP664上有細胞附著基序，對病毒進入細胞有重要作用。其它蛋白（如VP28、VP39B、VP41A、VP51A、VP51B、VP68、VP124、VP150、VP187、VP281和VP292）和膠原狀蛋白位于膜內；而蛋白VP35、VP466、VP15和VP76位于核衣殼上，具有不同的功能?？贵w分析表明，VP28和VP24可能與病毒的穿透作用有關。最近發(fā)現，對蝦血細胞中的25-Kda膜蛋白能結合到重組VP28，即WSSV病毒體上。這種蛋白質與小分子GTP-結合蛋白Rab7高度同源。以Rab7抗體進行的中和試驗表明，它能抑制WSSV病毒體與細胞結合，減少WSSV感染后的死亡。第六頁，共三十八頁，2022年，8月28日用RNA干擾法研究與VP19相對應的長雙鏈RNA能誘導凡納濱對蝦特殊的抗病毒反應，抑制WSSV感染，大幅度降低死亡率。而相應的VP28、VP281、WSSV蛋白激酶（PK）及不相關的綠色熒光蛋白的長雙鏈RNA能提高中國明對蝦的成活率，用VP28和PK雙鏈RNA處理的對蝦成活率最高。連續(xù)3次注射短小的VP28干擾RNA，完全抑制了WSSV對日本對蝦的感染。第七頁，共三十八頁，2022年，8月28日WSSV基因組含531-684個閱讀框，具ATG啟動密碼子，其中181-184閱讀框編碼含51-6077個氨基酸組成的功能蛋白，相當于基因組遺傳信息的92%。約21%-29%的閱讀框編碼WSSV蛋白，即與其他已知蛋白相同。這些蛋白包括核酸代謝和DNA復制酶，如DNA聚合酶、非特異性核酸酶、核苷酸還原酶的大小亞基、胸苷激酶、胸苷酸激酶、嵌合的胸苷-胸苷酸激酶、胸苷酸合成酶、dUTP酶和兩種激酶。推測還有其他功能蛋白，如膠原狀蛋白、鞭毛蛋白、幾丁質酶、蛹殼狀蛋白、細胞表面絮狀蛋白、kunitz狀蛋白酶抑制因子1類細胞因子受體、sno狀肽和嵌合抗凋亡蛋白。有3個閱讀框（泰國隔離群的151、366和418）可編碼WSSV潛伏期的蛋白。第八頁，共三十八頁，2022年，8月28日WSSV還有3個能立即轉錄的即時早期基因（臺灣隔離群的26、242和418閱讀框）。這些基因獨立轉錄，與寄主細胞從頭合成的病毒蛋白無關，在體外直接表達。這些即時早期基因在感染期間決定寄主范圍，調節(jié)反式作用因子。編碼DNA復制和核苷酸代謝所需的蛋白在病毒復制初期即開始了轉錄合成。初期轉錄的WSSV基因一般具有TATA框，轉錄起始位點上游具有20-30核苷酸。結構蛋白是在感染后期合成的，一般有簡并TIS基序（A/TNAC/G）），該序列位于富含A/T區(qū)下游25個堿基的位置，與節(jié)肢動物的TIS基序相似。WSSV有一個內核糖體進入位點（IRES）元件，它能使以雙順反子形式構建的谷胱甘肽S轉移酶（GST）和綠色熒光蛋白（GFP）在體外同時有效地表達。第九頁，共三十八頁，2022年，8月28日泰國、中國大陸和臺灣WSSV隔離群的核苷酸序列有99.3%相同。WSSV基因組的不同區(qū)域表現出重要的序列變異。我國WSSV基因組有9.63kbp的不穩(wěn)定區(qū)，依寄主的不同發(fā)生了不同程度的缺失，使致毒力發(fā)生了變化。還有人認為，不同WSSV隔離群的毒力和競爭性適應的差異取決于基因組的大?。夯蚪M最大的WSSV（312kbp）致毒力最低（半致死時間=12d），競爭性適應程度最小。這與生長中觀察到的發(fā)病期對蝦的死亡率不同有關。

WSSV品系的遺傳性、抗原和毒力

第十頁，共三十八頁，2022年，8月28日WSSV的形態(tài)發(fā)生

(1)有感染性的WSSV,(2)有感染性的WSSV病毒體用具有細胞附著基元的膜蛋白附著到易感染細胞上，(3)WSSV進入細胞，(4)WSSV的膜與內體融合，裸露的核殼體用類似于桿狀病毒的方法轉移到細胞核內，(5)裸露的WSSV核殼依附到核膜上，WSSV的基因組釋放進細胞核中，(6)WSSV的基因組開始復制，線粒體開始退化，(7)在細胞核內出現早期病毒發(fā)生基質。它由稀疏的顆粒物質組成。細胞內的染色質積聚在核膜附近。粗面內質網膨大而活躍。(8)邊緣的染色質變?yōu)闈饷艿沫h(huán)狀區(qū)（陰影部分）。病毒發(fā)生時基質變淡，開始形成囊泡，囊泡會變成病毒膜。這些囊泡可能由環(huán)狀區(qū)的膜物質構成。病毒的核小體在病毒發(fā)生基質中呈絲狀結構。(9)在細胞核（電子密度高的內含物）內組裝成新的WSSV。空殼膜內充滿核殼。細胞質內的細胞器解體，細胞和細胞膜破裂。(10)形成完整的WSSV病毒體即將從破裂的細胞中釋放出來，開始感染新的細胞（新的循環(huán)）。第十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日1期：細胞感染初期。被感染細胞的細胞核略膨大。病毒顆粒形成之前先出現病毒核小體。病毒顆粒由纖維狀的病毒蛋白形成。細胞質中內質網膨大，具有大量游離核糖體。2期：細胞核內的纖維物質誘導形成環(huán)形膜，膜上很快就充滿了病毒核物質，開始了病毒的組裝。此期在病毒發(fā)生基質和高電子密度的邊緣染色質之間的半透明區(qū)內出現Cowdry-A型內含物。細胞核膨脹呈圓形。第十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日3期：在細胞核內出現了核殼。核殼電子密度低，由一端向另一端生長，初為開口。因具有大量病毒顆粒，中部核內含物比第2期的細胞小，電子密度高。邊緣染色質消失時，核膜破裂，邊緣透明區(qū)與發(fā)亮的細胞質融合。大多數細胞器異常，分離，形成膜結構。4期：細胞核內的核殼形成致密的12-14圈球蛋白單位。每個核殼的一端圓、一端方，由膜完全包圍起來。第十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日5期：病毒形成的后期。病毒顆粒呈卵形，可見到由膜衍生成的長尾狀突起。尾內物質脫離核殼，之后因病毒內有DNA-VP15復合物而變短，增厚，電子密度增加。6期：形態(tài)發(fā)生的最后階段。成熟的病毒體橢圓形，光滑的膜包圍高電子密度的核衣殼，在最后包被的一端有尾狀突出。有時組裝完的核殼與膜完全脫離，而褶皺。在這最后階段，感染的細胞嚴重損傷，隨著細胞解體，組織中出現一些空泡。第十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日原位雜交表明，WSSV主要在斑節(jié)對蝦仔蝦胃角質層下的皮下細胞和鰓皮下及肝胰臟細胞中復制；也有人認為是在中腸干上皮細胞中復制。在24-26℃下，體長2-3cm的日本對蝦人工感染WSSV后3d，各組織器官內未觀察到明顯的病毒感染陽性細胞；第4d首先在鰓絲腔內的少量血細胞中觀察到病毒感染；第5d除血細胞外，同時在血竇鰓上皮組織、皮下組織內觀察到；第6d在心臟、胃上皮組織內觀察到；第7d在淋巴器官、中腸內觀察到；第8d和第9d所有樣品上述組織器官中均為WSSV病毒陽性。病毒從最初的復制部位擴展到其他靶器官有二種途徑：螯蝦等是通過血細胞到達遠處的靶器官；淡水蝦和對蝦等是通過游離血淋巴循環(huán)到達靶器官。PCR檢測表明，至少有18種養(yǎng)殖或野生對蝦、8種真蝦、7種龍蝦、7種螯蝦、38種蟹、6種非甲殼動物、輪蟲和毛顎動物及一些水生昆蟲幼蟲呈WSSV陽性，多數為WSSV的機械攜帶者。第十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日阻斷病毒感染的新途徑目前應用研究的進展：1.抗病轉基因育種：通過轉基因的方法將某種基因導入蝦體，培育優(yōu)質抗病對蝦新品種。

1）導入核酶基因，切斷核酸合成技術路線：2）導入包膜蛋白的反意RNA，阻斷翻譯包膜蛋白

3）導入新包膜蛋白基因，翻譯錯誤的包膜蛋白例子：利用基因槍轉移以綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因作為報告基因的重組抗WSSV核酶基因的質粒

pCDNA-RZI，成功得到轉GFP基因的中國對蝦。第十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日阻斷病毒感染的新途徑2.基因工程藥物：原理：阻斷病毒與被感染細胞表面受體的結合，降低致病力；誘導產生“類免疫應答”(quasi-immuneresponse)。例子：1）用大腸桿菌(Escherichiacoli)表達的重組

WSSV囊膜蛋白rVp28口服免疫斑節(jié)對蝦，7天浸溶攻毒免疫保護率達77%；

2）用大腸桿菌表達的重組WSSV囊膜蛋白rVp28和核衣殼蛋白rVp26肌肉注射免疫日本對蝦，30天注射攻毒免疫保護率達分別為95%和60%；

3)以家蠶核多角體病毒（BombyxmoriL.nuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV）表達系統(tǒng)表達的WSSV囊膜蛋白rVp28和rVp19口服免疫克氏原螯蝦，30天口服攻毒免疫保護率高達97%。第十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日昆蟲桿狀病毒載體系統(tǒng)1.昆蟲桿狀病毒：它個體最大，能容許基因較大區(qū)域的缺失或替換，能容納大片段外源DNA的插入，增加外源基因表達的有效途徑。去除某些基因，如半光氨酸蛋白酶、組織蛋白酶、幾丁質酶基因能增進重組蛋白的穩(wěn)定性。2.桿狀病毒表達載體系統(tǒng)：是一種輔助性依賴（僅指粒載體不能表達外源基因）的真核DNA

表達載體；以昆蟲桿狀病毒，主要是家蠶核多角體病毒為外源基因載體，以昆蟲或其細胞為受體的表達系統(tǒng)。第十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日家蠶（BombyxmoriL.nuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV）表達系統(tǒng)生產預防WSSV蛋白特點：家蠶具開放式血管系統(tǒng)，纖薄而強韌的表皮層包圍著充滿血淋巴及各種器官的空間，是個微妙的高效“發(fā)酵罐”；產物能糖基化、磷酸化、酰胺化等各種修飾作用。程序：1)目的基因克隆進桿狀病毒載體質粒內；2）與野生型病毒基因組一起共轉染蠶體細胞；3）檢測出表達的抗原性蛋白；4）用于實驗對蝦。第十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十一頁