臨床免疫學檢驗：8 Ig分純

抗血清（Ig)的分離提純P24

目的有利于標記減少非特異性反應有利于Ig定量分離提純方法鹽析法(P20)（一）原理在不同濃度的中性鹽中蛋白質(zhì)會脫水，降低帶電電勢，由親水膠體變?yōu)槭杷z體，分子間相互凝聚而沉淀（鹽析作用）。不同蛋白質(zhì)鹽析所需中性鹽的濃度不同，故可分離不同蛋白質(zhì)。親水膠體分離蛋白質(zhì)所用硫酸胺的濃度纖維蛋白原20%飽和度球蛋白、部分、33%飽和度球蛋白白蛋白

>50%飽和度

｛（二）常用的中性鹽：硫酸胺硫酸胺鹽析的優(yōu)點溶解度大（飽和700~800g/1000ml)溶解度受溫度影響小蛋白質(zhì)不易變性操作簡便缺點1.需除去NH4+，透析時間長2.含氮，干擾蛋白質(zhì)定量3.不純的硫酸胺含有金屬，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，因此硫酸胺需用分析純試劑（三）方法：1.配制飽和硫酸胺溶液2.加入稀釋血清3.透析去除NH4+(奈氏試劑檢測）稀釋血清磁塊磁力攪拌器硫酸胺鹽析示意圖

1.計算并加入所需的硫酸胺量（ml）

2.攪拌過程中緩慢加入稀釋血清注意點：pH

硫酸胺pH應接近蛋白質(zhì)的等電點，才易形成沉淀（Ig

的pI=7.3~8.2，pH應7.7左右）蛋白質(zhì)濃度

2.5~3%為宜，所以血清要稀釋溫度室溫即可（除特殊要求者）二.離子交換層析法

(P20)

原理利用不同的蛋白質(zhì)在緩沖溶液中所帶電荷不同，與某一載體上的具有相反電荷的離子基團進行吸附，然后進行解脫，達到純化蛋白質(zhì)目的。常用載體是纖維素（DEAE）

例如在PH6.5的醋酸緩沖液中，侵泡DEAE，使DEAE帶正電，因此它能吸附帶負電的Alb、α、β球蛋白（其PI均<6，PH6.5＞PI，帶負電），僅γ球蛋白PI為7.3，帶正電（PH6.5<PI，帶正電）不能被DEAE吸附而直接流出，此時收集的第一峰即為提純的γ球蛋白。然后通過改變緩沖液PH和離子強度，使Alb、α、β依次洗脫下來。方法：1.用酸處理載體二乙氨乙基纖維素（DEAE），使其帶正電荷2.裝柱3.加入蛋白質(zhì)溶液，過柱時帶負電的蛋白質(zhì)吸附于載體上，帶正電的蛋白質(zhì)流出4.然后用堿性溶液洗脫離子交換層析先將處理后的纖維素裝柱，再從上加入要分離的蛋白質(zhì)溶液。當?shù)鞍踪|(zhì)溶液全部進入纖維素柱中后，改變緩沖液pH，進行洗脫。三.凝膠過濾（層析）法（P20）原理：

凝膠顆粒是網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，當分子大小不同的混合物流經(jīng)凝膠柱時，大分子蛋白質(zhì)不易進入凝膠網(wǎng)格，只能分布于凝膠顆粒間，因此在洗脫時向下移動速度快，最先被洗脫下來；小分子蛋白質(zhì)則嵌入凝膠顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，洗脫時向下移動速度慢，較晚被洗脫，從而將分子大小不同的物質(zhì)分離，即為分子篩的作用。常用凝膠：葡聚糖凝膠Sephadex聚丙烯酰胺凝膠Sephacryl瓊脂糖凝膠Sepharose常用葡聚糖凝膠Sephadex的型號型號：G10、25、50、75、100、150、200蛋白質(zhì)孔徑愈小，選用型號愈小不同型號分離蛋白質(zhì)大小不同，分離Ig

多用G150方法：1.用緩沖液浸泡凝膠干粉，使其充分膨脹2.裝柱3.蛋白質(zhì)溶液過柱，收集過柱后的蛋白質(zhì)溶液，一般5ml/小時凝膠過濾層析緩沖液持續(xù)沖洗凝膠裝柱凝膠過濾分離的優(yōu)點：1.使用單一緩沖液，不需梯度洗脫2.重復性好，樣品回收率高3.不引起蛋白質(zhì)變性和失去生物學活性缺點：1.凝膠網(wǎng)格孔徑大小有限，限制分離物2.凝膠可吸附芳香類、脂蛋白等物質(zhì)，影響分離效果3.過濾速度慢（5ml/h），上樣后要走1-2天四.親和層析法（P20)原理：

利用抗原抗體的結(jié)合具有特異性、可逆性，將純化抗原先交聯(lián)到載體上，制成親和層析柱，當Ab（Ig）通過時，與抗原在柱上特異性結(jié)合，Ab中雜質(zhì)流出。然后通過改變緩沖液pH、離子強度，使Ab解脫下來。方法：1.親和層析柱制備

Sepharose4B

吸附特異Ag

裝柱2.蛋白質(zhì)溶液過柱（特異性Ag與相應Ab結(jié)合）3.改變緩沖液pH沖洗柱子，使Ag、Ab分離，收集Ab溴化氰優(yōu)點：

分離的Ig很