分子生物學(xué)第8章

第八章印跡雜交技術(shù)分子生物學(xué)常用的分析技術(shù)之一DNA印跡法、RNA印跡法和蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡法）

第一節(jié)核酸分子雜交

核酸雜交技術(shù)是在DNA變性和復(fù)性原理的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種分子生物學(xué)技術(shù)

一、變性（denaturation）在某些理化因素的作用下，維系核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈的過(guò)程稱(chēng)為核酸的變性核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，但并不涉及共價(jià)鍵的斷裂DNA解鏈曲線(xiàn)DNA變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂核酸的變性因素變性方法熱變性、酸堿變性、化學(xué)變性劑（乙醇、尿素和甲酰胺）增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）由于DNA變性而引起的光吸收增加的現(xiàn)象使雙鏈DNA解鏈度達(dá)到50%所需的溫度稱(chēng)為解鏈溫度(Tm)、變性溫度、熔點(diǎn)

DNA的解鏈溫度一般在82-95℃

，與DNA的分子大小和堿基組成、溶液的pH值和離子強(qiáng)度（+）等有關(guān)

二、復(fù)性DNA復(fù)性：緩慢降溫可以使熱變性DNA重新形成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)DNA的最適復(fù)性溫度通常比解鏈溫度低20-25℃復(fù)性導(dǎo)致DNA的紫外吸收降低，稱(chēng)為減色效應(yīng)檢測(cè)DNA紫外吸收的變化可以分析其變性和復(fù)性

不是簡(jiǎn)單的逆變性過(guò)程，受多種因素影響:①DNA濃度越高，兩股互補(bǔ)鏈相遇的可能性就越大，因而復(fù)性越快②序列簡(jiǎn)單的DNA(例如重復(fù)序列)復(fù)性快，序列復(fù)雜的DNA(例如單一序列)復(fù)性慢，因而可以通過(guò)測(cè)定復(fù)性速度分析DNA序列的復(fù)雜性③DNA片段越大，尋找完全互補(bǔ)序列的難度就越大，因而復(fù)性越慢④DNA溶液的離子強(qiáng)度越高，兩股互補(bǔ)鏈重新結(jié)合的速度就越快，因而復(fù)性越快變性復(fù)性

DNA-DNA雜交雙鏈分子三、雜交與核酸分子雜交技術(shù)

雜交定義不同來(lái)源的、序列互補(bǔ)的單鏈RNA、DNA，或DNA和RNA，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，借助氫鍵連接為雙鏈分子的過(guò)程。核酸雜交類(lèi)型單鏈DNA與單鏈DNA雜交（DNA-DNA）單鏈DNA與單鏈RNA雜交（DNA-RNA）單鏈RNA與單鏈RNA雜交（RNA-RNA）核酸分子雜交技術(shù)定義：將已知序列的單鏈核酸片段進(jìn)行標(biāo)記后，再與另一種未知序列的待測(cè)核酸樣品進(jìn)行雜交，從中鑒定互補(bǔ)序列，以分析該樣品中是否存在特定基因序列、基因序列是否存在變異，或研究目的基因的表達(dá)情況探針(Probe)：是帶有標(biāo)記物且序列已知、用于鑒定互補(bǔ)序列的單鏈核酸片段根據(jù)雜交體系的不同，核酸分子雜交可以分為：1、液相雜交：待測(cè)核酸和標(biāo)記的探針都游離于溶液中，在一定條件下進(jìn)行雜交優(yōu)點(diǎn)：速度快、效率高，操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：難以有效避免待測(cè)核酸的復(fù)性雜交之后也不易將未雜交的多余探針完全除去，誤差較大2、固相雜交：將待測(cè)核酸先固定在固相支持物上，然后與溶液中的游離探針進(jìn)行雜交，形成的雜交體結(jié)合在固相支持物上優(yōu)點(diǎn)：既可以避免待測(cè)核酸的復(fù)性，又可以通過(guò)漂洗除去末雜交的多余探針，而且結(jié)合在固相支持物上的雜交體的檢測(cè)也很方便印跡雜交技術(shù)中的核酸分子雜交就是以固相雜交為基礎(chǔ)的第二節(jié)探針與標(biāo)記

合適的探針具備以下條件:①具有高度特異性，只與待測(cè)核酸雜交。因此，通常首選編碼序列制備探針②為單鏈核酸，用雙鏈核酸制備的探針使用前要先變性解鏈③帶有標(biāo)記物，標(biāo)記物靈敏度高而穩(wěn)定，檢測(cè)方便

一、探針?lè)N類(lèi)

1·基因組DNA探針（最常用的DNA探針）多為某一基因的全部序列或部分序列2·RNA探針雜交效率高、穩(wěn)定性高、敏感性和均一性強(qiáng)非特異性雜交較少、低本底3·cDNA探針

不含內(nèi)含子等非編碼序列，特異性高，研究基因表達(dá)不易制備4·寡核苷酸探針

根據(jù)已知核酸序列人工合成的DNA探針;分析點(diǎn)突變5·鎖式探針

一種特別設(shè)計(jì)的DNA探針，中間為連接序列6·實(shí)時(shí)定量PCR探針

二、探針標(biāo)記物

(一)放射性同位素標(biāo)記物(32P、2H和32S)極高的靈敏度和特異性放射性污染,半衰期短,昂貴(二)非放射性標(biāo)記物(生物素、地高辛和熒光素等)實(shí)驗(yàn)周期短;穩(wěn)定性好,標(biāo)記探針可以長(zhǎng)時(shí)間存放備用;無(wú)放射性污染靈敏度和特異性有時(shí)不理想三、探針標(biāo)記法1、體內(nèi)標(biāo)記：將放射性化合物加入培養(yǎng)基，由細(xì)胞吸收之后經(jīng)過(guò)合成代謝摻入新合成的核酸分子2、體外標(biāo)記（最常用）：化學(xué)法和酶促法化學(xué)法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針?lè)肿由系幕鶊F(tuán)進(jìn)行交聯(lián)，將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針?lè)肿由稀：?jiǎn)便快速、標(biāo)記均勻酶促法：先用標(biāo)記物標(biāo)記核苷酸，再通過(guò)酶促反應(yīng)將標(biāo)記核苷酸摻入探針?lè)肿?，或?qū)?biāo)記基團(tuán)從核苷酸轉(zhuǎn)移到探針?lè)肿?/p>

(一)切口平移標(biāo)記法

(二)隨機(jī)引物標(biāo)記法

末端標(biāo)記法(三)聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記法一種標(biāo)記dNTP和三種普通dNTP為底物，短鏈探針(四)末端標(biāo)記法T4多核苷酸激酶、末端轉(zhuǎn)移酶、Klenow片段和T4DNA聚合酶

四、探針純化1·乙醇沉淀法

DNA片段可以被無(wú)水乙醇沉淀操作簡(jiǎn)便，首選方法2·凝膠過(guò)濾法

利用凝膠的分子篩特性凝膠填料是SephadexG-50和Bio-GelP-60第三節(jié)固相支持物與印跡

一、固相支持物：硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和活化濾紙1·硝酸纖維素膜結(jié)合量大、本底較低、操作簡(jiǎn)便結(jié)合力不強(qiáng)，堿性、真空烘烤破裂變脆2·尼龍膜韌性較強(qiáng)，不易破裂中性尼龍膜和正電荷修飾尼龍膜二、印跡方法

第四節(jié)常用核酸印跡雜交技術(shù)

常用的核酸分子雜交技術(shù)多為固相雜交根據(jù)操作方法的不同分為印跡雜交：將凝膠電泳的高分辨率與核酸分子雜交的高靈敏度相結(jié)合，包括DNA印跡法和RNA印跡法等原位雜交：包括組織原位雜交法及菌落雜交法、噬菌斑雜交法等核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測(cè)核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段雜交加入標(biāo)記核酸探針檢測(cè)雜交信號(hào)標(biāo)記核酸探針預(yù)雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針一、DNA印跡法

1.樣品制備；2.電泳分離；3.變性；4·印跡；5·固定；6·預(yù)雜交；7.雜交；8·洗膜；9·分析放射自顯影照片二、RNA印跡法

RNA印跡法分析的待測(cè)核酸是RNA與DNA印跡法基本一致，所不同的是:

①為了保持RNA呈單鏈狀態(tài)進(jìn)行電泳，以使RNA按分子大小分離，需要先用變性劑將RNA樣品完全變性，再電泳分離

②RNA樣品只能用甲醛、乙二醛、二甲基亞砜(DMSO)等變性，不能用堿變性，因?yàn)閴A會(huì)導(dǎo)致RNA降解。RNA印跡法可以用于定性或定量分析組織細(xì)胞內(nèi)的總RNA或某一特定RNA，特別是分析mRNA的大小和含量，從而研究基因表達(dá)。避免RNase污染，包括抑制內(nèi)源性RNase的活性三、斑點(diǎn)雜交法和狹縫雜交法將粗制或純化的DNA或RNA樣品變性之后直接點(diǎn)于固相膜表面，經(jīng)過(guò)固定、預(yù)雜交之后與過(guò)量探針進(jìn)行雜交分析印跡:圓斑(dot),短線(xiàn)(slot)用于檢測(cè)DNA樣品的同源性、細(xì)胞內(nèi)特定基因的拷貝數(shù)和基因表達(dá)情況優(yōu)點(diǎn):用樣量少，操作簡(jiǎn)便，不電泳和轉(zhuǎn)移，在同一張固相膜上可以分析多個(gè)樣品缺點(diǎn):特異性不高,不能分析樣品的分子量

斑點(diǎn)雜交和狹縫雜交制備樣品→點(diǎn)樣→固定（可用斑點(diǎn)雜交儀或直接點(diǎn)樣）優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、靈敏、樣本用量少缺點(diǎn)：特異性不高，有一定比例的假陽(yáng)性四、組織原位雜交(insituhybridization)把組織切片進(jìn)行適當(dāng)處理，增加細(xì)胞膜的通透性，然后置于含探針的雜交液中，使探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA或RNA雜交以cDNA為探針檢測(cè)與其互補(bǔ)的mRNA在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置，稱(chēng)為RNA原位雜交，是分析基因表達(dá)的常用方法不需提取核酸，保持組織和細(xì)胞的形態(tài)，分析待測(cè)核酸的組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞甚至染色體定位分析特定基因表達(dá)情況、病原體的存在部位和方式熒光原位雜交(FISH)是用熒光素標(biāo)記探針進(jìn)行的原位雜交①靈敏、穩(wěn)定、安全、直觀②多色熒光原位雜交可以同時(shí)分析多種靶序列熒光標(biāo)記探針檢測(cè)精子五、菌落雜交和噬菌斑雜交

六、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)

ASOH：最早檢測(cè)已知點(diǎn)突變，目前廣泛采用的基因診斷方法關(guān)鍵：設(shè)計(jì)一對(duì)ASO，長(zhǎng)度15-20nt，只有一個(gè)堿基不同，對(duì)應(yīng)突變位點(diǎn)（正常探針，突變探針）診斷遺傳病，例如診斷苯丙酮酸尿癥(PKU)，根據(jù)某個(gè)突變位點(diǎn)(例如Arg243Gln)設(shè)計(jì)一對(duì)探針:用兩種探針?lè)謩e和待測(cè)DNA雜交，顯性純合子只與正常探針雜交，雜合子與正常和突變探針都雜交，隱性純合子只與突變探針雜交，因此根據(jù)雜交結(jié)果可以判斷待測(cè)個(gè)體的基因型苯丙酮酸尿癥患者基因型是隱性純合子第五節(jié)影響雜交的因素

核酸分子雜交的效果取決于雜交的特異性和雜交的效率1·核酸分子大（↓）小和濃度（正相關(guān)）發(fā)生碰撞才可能雜交2·探針?lè)N類(lèi)和濃度：?jiǎn)捂溙结橂s交效率會(huì)隨著濃度的增加而提高，雙鏈探針與此相反3·雜交溫度：最適雜交溫度(比解鏈溫度低20-25℃時(shí))；特異性4·↓離子強(qiáng)度和↑甲酰胺濃度：↓最適雜交溫度5.雜交時(shí)間：控制在20小時(shí)左右6·雜交促進(jìn)劑:＞250nt探針雜交用惰性多聚體(硫酸葡聚糖/PEG)7.非特異性雜交：預(yù)雜交，即用封閉物（變性的非特異性DNA、高分子化合物）封閉非特異性雜交位點(diǎn)第六節(jié)蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法可以用于定性和半定量分析混合物中的蛋白質(zhì)綜合了聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高和固相免疫分析特異性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)一、基本內(nèi)容

二、注意事項(xiàng)1·選用合適的聚丙烯酰胺凝膠濃度2·印跡時(shí)，應(yīng)選用小孔徑的固相膜，以免小分子量蛋白質(zhì)透過(guò)固相膜丟失3·蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)弱受多種因素的影響，所以一般只用于半定量分析即測(cè)定目的蛋白的相對(duì)含量，確定該目的蛋白是否存在，比較其在不同細(xì)胞內(nèi)的含量不同目的蛋白用不同抗體檢測(cè)時(shí)，分析結(jié)果沒(méi)有可比性三種印跡技術(shù)的比較第七節(jié)生物芯片

定義：也稱(chēng)為生物微陣列，是指通過(guò)微電子、微加工技術(shù)，用生物大分子

(例如核酸、蛋白質(zhì))或細(xì)胞等在數(shù)平方厘米大小的固相介質(zhì)表面構(gòu)建的微型分析系統(tǒng)，用以對(duì)生物組分進(jìn)行快速、高效、靈敏的分析與處理種類(lèi)：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片、微流控芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室

固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼龍膜等特點(diǎn)：高通量、集成化、標(biāo)準(zhǔn)化和微型化

一、基因芯片（genechip）

DNA芯片、DNA微陣列、寡核苷酸微陣列定義:是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接將大量DNA探針以點(diǎn)涂的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可得出樣品的信號(hào)（即基因序列或表達(dá)的信息）基本原理依然是基于核酸分子雜交，屬于固相雜交不同：探針固相化、集成化并且不標(biāo)記;而待測(cè)樣品游離于液相并且被標(biāo)記

基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray

(一)基本原理和基本操作

基因芯片技術(shù)是以斑點(diǎn)雜交為基礎(chǔ)建立的高通量檢測(cè)DNA的技術(shù)基本操作分為四個(gè)步驟芯片制作樣品制備分子雜交檢測(cè)分析1·芯片制作一個(gè)復(fù)雜而精密的過(guò)程，需要專(zhuān)門(mén)的儀器(1)原位合成法:光引導(dǎo)原位合成法分子印章法(2)微量點(diǎn)樣法:噴墨打印（微孔）接觸打印（點(diǎn)樣針）2·樣品制備待測(cè)樣品（Cy3）；對(duì)照樣品（Cy5）3.分子雜交探針含量遠(yuǎn)多于待測(cè)DNA含量（雜交信號(hào)強(qiáng)弱與待測(cè)DNA含量成正比）優(yōu)化雜交條件：離子強(qiáng)度、溫度、時(shí)間4、檢測(cè)分析以?huà)呙鑳x對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，通過(guò)陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出來(lái)DNA芯片技術(shù)流程大規(guī)模基因芯片的應(yīng)用

(二)應(yīng)用

基因芯片技術(shù)的主要用途是進(jìn)行DNA測(cè)序和研究基因表達(dá)在這兩種用途的基礎(chǔ)上，基因芯