免疫組織化學

免疫組化概念

組織包埋液

步驟

抗原修復原因和方法

結果判斷假陰性假陽性

質量控制

表上的抗體

CD34，CD68

B細胞標記物

T細胞標記物：3、7

細胞角蛋白免疫組織化學

(Immunohistochemistry，IHC)南京鼓樓醫(yī)院病理科王景美

免疫組織化學概念免疫組織化學或免疫細胞化學應用免疫學(抗原抗體反應）和組織化學（化學顯色反應）的原理，對組織切片或細胞標本中的某些成份進行原位定性、定位甚至定量研究的技術。免疫組織化學的發(fā)展歷史1941：Coons－實用免疫熒光技術1970：Sternberger－抗體酶標技術（PAP法）1975：Kohler,Milstein－單克隆抗體技術1981：Hsu－ABC法90年代以來：SP法、原位雜交及原位PCR免疫組化技術等全自動免疫組化檢測系統(tǒng)及原理基本步驟結果判斷特點及存在的問題常用免疫組化抗體免疫組化的應用內(nèi)容

檢測系統(tǒng)及原理抗原與抗體抗原：指能刺激機體產(chǎn)生抗體，并能和該抗體發(fā)生特異性結合的外來物質?？贵w:多克隆抗體:由多個B細胞克隆產(chǎn)生的不同種類的免疫球蛋白,可與同一抗原的不同表位結合，可由多種動物產(chǎn)生，兔最常用單克隆抗體:由單一類別的免疫球蛋白組成，來源于單一B細胞，與抗原的特異表位結合，主要由鼠產(chǎn)生檢測系統(tǒng)：直接法、間接法直接法73substrate-chromogen顯色底物加底物產(chǎn)生有色終產(chǎn)物Enzyme酶primaryAb一抗Antigen抗原酶標一抗與組織抗原相結合酶分子直接標記第一抗體（酶標一抗）快速/簡便/專一性強。信號弱、敏感性差免疫熒光技術多數(shù)采用此法，熒光素直接標記在一抗上現(xiàn)極少用71酶標二抗與非標記的一抗相結合如果一抗是鼠來源的，二抗必須抗鼠免疫球蛋白。比直接法敏感，因為多個二抗很可能與一抗上的多種不同表位結合，增加標記酶的數(shù)量。76間接法二步間接法77primaryAb(mouse)非標記一抗與組織抗原結合secondaryAb(rabbitanti-mouse)Enzyme酶標二抗與一抗相結合substrate-chromogen顯色底物加底物產(chǎn)生有色終產(chǎn)物PAP法ABC法鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶連接法（LSAB/SP法）

二步法(Envision系統(tǒng))二抗和辣根過氧化物酶(HRP)結合在多聚葡萄糖骨架上，形成多聚體。直接放大信號40-50倍間接法大多數(shù)實驗室現(xiàn)在使用:卵白素-生物素過氧化物酶系統(tǒng)（如

ABC,SABC,LSAB）多聚物檢測系統(tǒng)（如EnVision）這些系統(tǒng)對大多數(shù)抗體來說穩(wěn)定且靈敏以前普及的

PAP方法（過氧化物酶抗過氧化物酶）現(xiàn)在已較少使用

免疫組織化學方法的基本步驟1、組織細胞的準備

固定—取材—脫水—透明—浸蠟—包埋切片組織

固定液

10％中性福爾馬林緩沖液：最好、最經(jīng)濟和廣泛適用的固定劑，形態(tài)及抗原保存俱佳（需用有效的抗原修復）其它固定液：如含酸或含汞的固定液，就抗原保存來說均不理想某些商品化的固定液：保存抗原較佳，且價格昂貴組織固定時間

為確定組織在中性福爾馬林液中固定的最佳時間，需要權衡下列因素：盡量縮短固定時間，但至少要固定24小時長時間的福爾馬林固定會引起抗原性丟失（雖然可通過適當?shù)目乖迯驮谀撤N程度上逆轉）取材

脫水透明浸蠟

包埋切片封片HE染色及選擇蠟塊和抗體HE染色挑選免疫染色的組織塊

選含有明確的病變組織塊做免疫組化，并盡可能避免下列組織塊：后來另取的組織（固定時間過久）凍融后的組織脫鈣的組織（有些抗原可能丟失或減弱）壞死或/和出血過多的組織

免疫組織化學方法的基本步驟1、組織細胞的準備固定—取材—脫水—透明—浸蠟—

包埋切片—HE染色—選擇蠟塊和抗體2、組織切片的脫蠟和抗原修復抗原修復

應用物理或化學的方法將組織固定過程中封閉的抗原決定簇修復暴露的過程稱為抗原修復。

抗原修復

原因：甲醛固定過程中形成醛鍵而封閉部分抗原決定簇；甲醛在保存過程中形成羧甲基，封閉抗原決定簇；固定時，蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián),可能會封閉抗原決定簇?？乖迯偷姆椒ǖ鞍姿饷福阂鹊鞍酌?、胃蛋白酶和組織蛋白酶熱抗原修復（HIER）--最常采用超聲波以上綜合運用熱誘導的抗原修復水?。何⒉t、高壓鍋、高壓消毒鍋、蒸汽室及煮沸等。需不同濃度和pH值的緩沖液：常用

citrateatpH6.0,EDTAatpH8.0,

Tris-HCLatpH10.057熱修復的優(yōu)點：更有效：染色結果更一致，操作更單一；事先確定的熱修復時間可適用于幾乎所有的組織

一抗可以進一步稀釋（節(jié)省費用）有些抗體只有采用熱抗原修復才有效NoAntigenRetrieval不修復處理Citratebuffer,pH6.0

檸檬酸緩沖液58

經(jīng)抗原修復處理和不處理時,CD3在扁桃體組織上的染色效果

免疫組織化學方法的基本步驟1、組織細胞的準備固定—取材—脫水—透明—浸蠟—

包埋切片—HE染色—選擇蠟塊和抗體2、蠟塊組織脫蠟和抗原修復3、組織抗原和一抗結合反應注意最佳的一抗滴度時間不宜過長、過短溫度不宜過高溶液不宜過少洗滌充分

免疫組織化學方法的基本步驟1、組織細胞的準備固定—取材—脫水—透明—浸蠟—

包埋切片—HE染色—選擇蠟塊和抗體2、蠟塊組織脫蠟和抗原修復3、組織抗原一抗結合反應4、一抗和橋抗的結合反應

免疫組織化學方法的基本步驟1、組織細胞的準備固定—取材—脫水—透明—浸蠟—

包埋切片—HE染色—選擇蠟塊和抗體2、蠟塊組織脫蠟和抗原修復3、組織抗原一抗結合反應4、一抗和橋抗的結合反應5、顯色、襯染結果觀察AEC

DABMart-1Melanoma66AEC和DAB染色圖例SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAparaffinwax石蠟Paraffinwax

tissuesection石蠟包埋組織片二步法染色步驟舉例(CEA)SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAtissuesection組織片DeparaffinizationandRehydration脫蠟\水化SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEA3%HydrogenPeroxideDeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶3%過氧化氫10分鐘滅活內(nèi)源性過氧化氫酶SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAPBSBufferDeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶RinsePBS洗三次20:00SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEARinseAntigenRetrieval抗原修復DeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶檸檬酸緩沖液微波修復20分SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAPBSBufferRinseDeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復Rinse蒸餾水沖洗后,PBS洗3次SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEACEAAntibodyPrimaryAntibody一抗DeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復RinseRinse最適稀釋的CEA抗體孵育60分鐘SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAPBSBufferBlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復PrimaryAntibody一抗RinseRinseRinsePBS洗3次DeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAAntibody-HRP

SecondaryAntibody葡聚糖二抗RinseDeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復PrimaryAntibody一抗RinseRinse二抗孵育20分鐘SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAPBSBuffer

SecondaryAntibody葡聚糖二抗RinseDeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復PrimaryAntibody一抗RinseRinsePBS洗3次PBSBufferSPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEADABChromogenDABChromogenDAB底物DeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復PrimaryAntibody一抗SecondaryAntibody二抗

RinseRinseRinseRinseRinse加DAB10分鐘SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEADistilledWaterDeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復PrimaryAntibody一抗

SecondaryAntibody

二抗DABChromogenDAB底物RinseRinseRinseRinseRinseRinsePBS洗3次,蒸餾水清洗SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAMayer’sHematoxylinDeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復PrimaryAntibody一抗SecondaryAntibody

二抗DABChromogenDAB底物RinseRinseRinseRinseRinseRinseHematoxylinCounterstain蘇木精復染蘇木素復染1分鐘SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEATapWaterHematoxylinCounterstain蘇木精復染DeparaffinizationandRehydration脫蠟和水化BlockEndogenousPeroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復PrimaryAntibody一抗

SecondaryAntibody

二抗DABChromogenDAB底物RinseRinseRinseRinseRinseRinseRinse流水沖洗,細胞核返藍SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAAqueousMountDeparaffinizationand

Rehydration脫蠟和水化Block

Endogenous

Peroxidase阻斷內(nèi)源性過氧化物酶AntigenRetrieval抗原修復Primary

Antibody一抗

Secondary

Antibody二抗DAB

Chromogen

DAB底物RinseRinseRinseRinseRinseRinseHematoxylin

Counterstain蘇木精復染RinseAqueousMount水性封片封片注意顯色時間適當（要求鏡下觀察）襯染不宜太濃判斷染色質量觀察受染細胞

結果判斷嚴格抗原表達的部位和形式嚴格染色強度設對照：陽性、陰性對照或內(nèi)部對照當免疫組化結果與HE切片判斷有矛盾時,以HE切片診斷為準結果判斷？？？陽性反應的分布：不均勻性或異質性。陽性可出現(xiàn)在單個細胞內(nèi)、一群細胞中或整個組織中。彌漫一致的淺染可能為非特異性反應。陽性反應定位：胞膜，胞漿，胞核，胞核/胞漿明確定位(膜,漿,核)，是觀察免疫組化結果的最終依據(jù)！C-erbB2胞膜陽性Ki67胞核陽性CK7彌漫或片狀的細胞漿陽性CD68細胞漿內(nèi)顆粒狀陽性

Actin細胞漿纖維狀陽性S-100陽性的半定量－乘積法

強度：0分無色

1分淡黃色

2分棕黃色

3分棕褐色。細胞數(shù):0分無

1分≤10％

2分11－50％

3分51－75％

4分>75％。兩者乘積>3分為陽性。陽性的半定量－百分比

(+)陽性細胞數(shù)<25%(++)陽性細胞數(shù)>25%,<50%(+++)陽性細胞數(shù)>50%,<75%(++++)陽性細胞數(shù)>75%陽性細胞數(shù)<25%(++)25%<陽性細胞數(shù)<50%(+++)50%<陽性細胞數(shù)<75%(++++)陽性細胞數(shù)>75%免疫組織化學的特點和問題特異牲強敏感性高定位準確、形態(tài)與功能相結合假陽性假陰性非特異性技術本身的問題免疫組化的優(yōu)點特異牲強敏感性高定位準確、形態(tài)與功能相結合“一對一”的抗原抗體反應，如LCA顯示淋巴細胞。只有在組織細胞中存在交叉抗原時才會出現(xiàn)交叉反應。

免疫組化的優(yōu)點特異牲強敏感性高定位準確、形態(tài)與功能相結合

直接法，間接法：抗體的稀釋只能是幾倍、幾十倍。ABC法、SP法，兩步法等：抗體稀釋上百上千倍。越來越方便應用于臨床常規(guī)診斷工作

免疫組化的優(yōu)點特異牲強敏感性高

定位準確、形態(tài)與功能相結合

原位確定組織及細胞結構的化學成分.

方法統(tǒng)一,定性可靠、定位準確、定量可能。形態(tài)學被賦予了功能及代謝的含意。

假陰性與假陽性問題

假陰性原因抗原丟失抗原修復不適當方法不足夠敏感失效的抗體加錯試劑或試劑擺放位置錯誤假陽性原因

非特異性反應：邊緣現(xiàn)象；皺折和刀痕；出血和壞死；組織擠壓；被動吸收和主動吞噬而使抗原出現(xiàn)在不該出現(xiàn)的部位抗體與多種抗原有交叉反應內(nèi)源性酶的顯色試劑濃度過高異位抗原的表達非特異性著色（全片）1、抗體濃度過高2、抗體孵育時間過長或溫度較高3、DAB變質和顯色時間太長4、組織變干5、切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長6、一抗變質、質量差的多克隆抗體

邊緣效應“陰陽臉”著色試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部

固定不足、組織變干非特異性染色氣泡灶片狀著色1、裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起2、壞死組織灶3、制作APES涂膠片時，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著色灶狀著色：機械原因著色壞死組織著色：AE1/AE3非特異性反應,出血和壞死

胞漿著色過氧化物酶（紅細胞著色）

胞漿著色一抗過濃或交叉反應：P63（乳腺）

免疫組織化學的新進展高效的抗原修復技術（即使不同方式固定或處理的組織仍能得到一致的結果）高度敏感的檢測系統(tǒng)大量能應用于常規(guī)石蠟切片的抗體雙染甚至三染免疫組化技術免疫組化自動化抗體必須經(jīng)過驗證研究

由于組織固定、脫水過程、包埋等內(nèi)在影響因素的變化，不可能建立一個通用的免疫組化染色程序？對照的設立陽性對照與陰性對照內(nèi)對照空白對照組織微陣列免疫組化的質量控制常用免疫組化抗體上皮組織標記物間葉組織標記物淋巴造血系統(tǒng)標記物神經(jīng)及內(nèi)分泌標記物腫瘤相關抗原標記物器官或組織特異性抗原標記物病原體標記物1、上皮組織標記物

角蛋白系列（cytokeratin,CK）上皮膜抗原（epithelialmembraneantigen,EMA）癌胚抗原（carcinoembryonicantigen,CEA）CK的概述CK--抗體在外科病理實驗室應用最為廣泛多年以來由于各種特殊亞型的CK抗體出現(xiàn)使得CK的應用更加廣泛什么是CK?中間絲（重要的細胞骨架蛋白）見于所有的上皮細胞及間皮細胞整個家族中有40-68kD的不同分子量及等電點pH

至少有20個亞型（酸性或堿性）低分子量CK中間分子量

CK高分子量

CKCK-pan（如MNF-116）或雞尾酒調制CK（如MAK6）CAM5.234?E12AE1/AE3CK5/6什么是

CK?CK1，CK2和

CK10：最高分子量細胞角蛋白，僅表達在鱗狀上皮的角化層CK5,CK6和

CK14:高分子量細胞角蛋白，表達于鱗狀上皮及基底細胞CK7,CK8,CK18和

CK19:低分子量細胞角蛋白，表達在單層上皮和內(nèi)分泌細胞其它

CK亞型為中間分子量最常用，胞漿陽性著色，細絲狀，用于確定腫瘤為上皮源性波形蛋白（vimentin，VIM）肌組織標記物血管內(nèi)皮細胞的標記物組織細胞的標記物2、間葉組織標記物波形蛋白（vimentin，VIM）

中間微絲蛋白分布于間葉細胞及其起源的腫瘤也見于上皮性腫瘤已建議廢棄肌原性標記

?Desmin

胞漿陽性著色

平滑肌/骨骼肌及其腫瘤的良好標記，肌纖維母細胞有時也陽性，但肌上皮陰性

一些間皮瘤陽性

促結締組織增生性小圓細胞腫瘤

肌源性標記

?MSA（Muscle-specificactin）

胞漿陽性著色

極好的肌源性標記

平滑肌、骨骼肌及其腫瘤

肌纖維母細胞及相關腫瘤（惡纖組、結節(jié)性筋膜炎等）

肌上皮及其腫瘤

血管周細胞腫瘤

一些間皮瘤血管內(nèi)皮細胞的標記物

第八因子相關抗原（factorⅧrelatedantigen,F-8）荊豆凝集素（ulexeuropaeusUEA-1）

CD34CD31D2-40血管源性標記

?CD31

細胞膜陽性著色

內(nèi)皮細胞、巨核系細胞/血小板陽性

有時漿細胞/漿細胞瘤陽性

主要用于診斷血管性腫瘤：特異且敏感

用于識別骨髓中不正常的巨核細胞

用于巨核細胞系白血病血管源性標記

?CD34

細胞膜/細胞漿陽性著色

血管內(nèi)皮/巨核細胞/血小板

很好的血管標記，但特異性差

多種腫瘤CD34陽性，包括：血管瘤、血管周細胞胃腸間質瘤等組織細胞的標記物

α1–抗胰蛋白酶(α1-antitypsin,AAT)和

α1－抗糜蛋白酶（α1-antichymotrypsin,AACT）溶菌酶（lysozyme,Lys）CD68組織細胞標記

?CD68（PGM1）

胞漿內(nèi)顆粒狀陽性著色

較好的組織細胞和單核細胞及其腫瘤的標記

有些非組織細胞也可陽性，包括：腎小管、粒細胞肉瘤、惡黑、血管瘤樣惡纖組等

3、淋巴造血系統(tǒng)標記物

白細胞共同抗原（leucocytecommonantigen,LCA,CD45）免疫球蛋白(immunoglobulinIg)B細胞標記物

T細胞標記物

T淋巴細胞亞群標記物粒細胞和單核—巨噬細胞相關標記物其他白細胞標記

?LCA（CD45RB）

幾乎所有的白細胞、漿細胞瘤（+）

HE下明確的淋巴瘤不必要染LCA

有些淋巴母細胞淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤（-）

經(jīng)典Hodgkin的R-S細胞（-）

B細胞相關標記CD20（L26）胞膜陽性著色CD79a胞漿陽性著色:各階段B細胞陽性B祖細胞前B細胞未成熟的B細胞成熟的B細胞激活的

B細胞漿細胞前體細胞;非抗原依賴型初始

B細胞;非抗原依賴型生發(fā)中心和標志;抗原依賴型TdTCD20,CD22CD19,PAX5CD79aCD10Bcl-6CD138細胞漿

CD22

全T細胞標記物

CD3CD5CD7CD45ROCD43

用于T淋巴細胞和其起源腫瘤的識別T細胞相關標記

?CD3（polyclonal）

胞漿/膜陽性著色，核周凝聚，有時高爾基體也陽性

極好的T細胞標記，與CD43不同，髓系細胞和組織細胞不著色

極好的T細胞和NK淋巴瘤標記粒細胞和單核巨噬細胞相關標記物CDl5(LeuM1)髓過氧化物酶（MPO）CD68MAC387溶菌酶(lysome)組織細胞標記

?CD68（PGM1）

胞漿內(nèi)顆粒狀陽性著色

較好的組織細胞和單核細胞（包括漿樣單核細胞）及其腫瘤的標記

有些非組織細胞也可陽性，包括：腎小管、粒細胞肉瘤、惡黑、血管瘤樣惡纖組等

4、神經(jīng)及內(nèi)分泌標記物神經(jīng)組織標記物

膠質纖維酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)S-l00蛋白神經(jīng)元特異性烯醇酶(NeuronSpecificEnolase，NSE)髓磷脂堿性蛋白(Myelinbasicprotein，MBP)神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN)少突膠質細胞轉錄因子-2(Oligo-2)內(nèi)分泌和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)標記物垂體激素:GH、LH、ACTH、Prl、FSH、TSH胰島細胞、胃腸道和呼吸道激素神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NeuronSpecificEnolase，NSE)

嗜鉻顆粒蛋白(ChromograninA，CgA)

突觸囊泡蛋白(Synaptophysin，Syn)?GFAP（Glialfibrillaryacidicprotein）

胞漿陽性著色

星形細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、室管膜瘤和脈絡叢乳頭狀瘤陽性

一些外周神經(jīng)鞘瘤可陽性

涎腺多形性腺瘤?？申栃?/p>

乳腺的肌上皮有時也可陽性

S-100

細胞核、細胞漿陽性著色

神經(jīng)源性腫瘤、惡性黑色素瘤、肌上皮腫瘤、脂肪腫瘤?Syn

細胞漿陽性著色

神經(jīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞及腫瘤、神經(jīng)元和神經(jīng)節(jié)細胞（+）

特異性和敏感性均好

?CgA

胞漿內(nèi)顆粒狀著色

染神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的分泌小泡

類癌、Merkel細胞癌、甲狀旁腺腺瘤等強陽性

神經(jīng)性腫瘤可陽可陰

5、腫瘤相關抗原標記物腫瘤基因蛋白(oncoprotein)Bcl-2