第七章微生物遺傳與基因工程

第七章微生物遺傳與基因工程第一節(jié)微生物遺傳有關(guān)概念1遺傳性（inheritance）

生物的親代傳遞給其子代一套遺傳信息的特性遺傳型（genotype）

生物體所攜帶的全部基因的總稱有關(guān)概念2表型(phenotype)

具有一定遺傳型的個體，在特定的外界環(huán)境中，通過生長和發(fā)育所表現(xiàn)出來的種種形態(tài)和生理特征的總和。飾度（modification)

同型遺傳型的生物，在不同的外界條件下，會呈現(xiàn)不同的表型。變異（variation)

只有遺傳性的改變，即生物體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生的變化，才稱為變異。在群體中，自然發(fā)生變異的機率極低，但一旦發(fā)生后，卻是穩(wěn)定的和可遺傳的。微生物不同于其他生物的生物學特性1

單細胞體制或多細胞而極少分化的體制營養(yǎng)體多數(shù)是單倍體多數(shù)能在一定成分的培養(yǎng)基上迅速生長繁殖在固體培養(yǎng)基上能從單個細胞通過無性繁殖方式形成菌體微生物不同于其他生物的生物學特性2代謝作用旺盛環(huán)境因素對于分散的細胞起均勻而直接的作用有性世代在較短時間內(nèi)完成有最簡單的類型，例如病毒

DNA

螺旋體DNA結(jié)

構(gòu)模式真核生物和原核生物就遺傳物質(zhì)上的區(qū)別1

真核生物的遺傳物質(zhì)是DNA，原核生物的遺傳物質(zhì)是DNA或RNA；

真核生物的染色體由DNA及蛋白質(zhì)構(gòu)成，原核生物的染色體是單純的DNA或RNA；真核生物和原核生物遺傳物質(zhì)上的區(qū)別2

真核生物的染色體不止一個，原核生物的染色體往往只有一個；

真核生物的許多染色體為核膜所包被，原核生物的染色體外無膜包圍。1、DNA在真核生物中的存在狀態(tài)染色體DNA就含量言，真核生物高于原核生物，高等動物和植物又高于真核類微生物。染色體外的DNA以細胞器內(nèi)形式存在，常呈環(huán)狀，數(shù)量只占染色體DNA的1%以下。2、DNA在原核生物中的存在狀態(tài)染色體DNA細菌和放線菌的遺傳物質(zhì)是雙鏈DNA病毒為DNA或RNA，雙鏈或單鏈，線狀或環(huán)狀染色體外DNA即為細菌質(zhì)粒軟病毒

軟病毒蛋白細菌染色體(左）和質(zhì)粒（右）質(zhì)粒存在的三種形態(tài)細菌質(zhì)粒和真核生物細胞器DNA的共同點1、自體復(fù)制。2、一旦消失以后，后代細胞中不再出現(xiàn)3、它們的DNA只占染色體DNA的一小部分。細菌質(zhì)粒和真核生物細胞器DNA的區(qū)別1、成分和結(jié)構(gòu)簡單，一般都是較小的環(huán)狀DNA分子，并不和其他物質(zhì)一起構(gòu)成一些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。2、功能更為多樣化，可一般不是必需的。3、許多細菌質(zhì)粒能通過細胞接觸而自動地從一個細菌轉(zhuǎn)移到另一個細菌，使兩個細菌都帶有此質(zhì)粒。2、DNA的自體復(fù)制

定義：復(fù)制不是依靠細胞中酶的作用，而是指它的分子結(jié)構(gòu)的特異性由它本身所決定的。經(jīng)典實驗：利用同位素標記方法在大腸桿菌中進行試驗。密度梯度離心試驗結(jié)果以及半保留復(fù)制模型大腸桿菌DNA復(fù)制放射自顯影試驗細菌遺傳物質(zhì)的特性1

細菌代表大腸桿菌和其他原核生物中的基因數(shù)基本接近根據(jù)其基因組大小所估計的基因數(shù)，即這些微生物基因組DNA絕大部分用于編碼蛋白質(zhì)、RNA,用作為復(fù)制起點、啟動子、終止子和一些由調(diào)節(jié)蛋白識別和結(jié)合的位點等信號序列。

絕大部分原核生物不含內(nèi)含子，遺傳信息是連續(xù)而不中斷的。大腸桿菌總共有2584個操縱子。操縱子中73%只含有1個基因，16.6%含2個基因，4.6%含3個基因，6%含有4或4個以上基因。如此多的操縱子與原核基因的表達大多采用轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，組成操縱子有極為方便的一面。

大腸桿菌中功能相關(guān)的RNA基因也串聯(lián)在一起。如構(gòu)成核糖核蛋白體的3種RNA基因轉(zhuǎn)錄在同一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物16SrRNA-23SrRNA-5SrRNA中，三者比例為1：1：1。如它們不在同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，則可造成3種RNA比例失調(diào)，影響細胞功能，或需要一個極為復(fù)雜、耗費巨大的調(diào)節(jié)機構(gòu)來保證正常必須的1：1：1。細菌遺傳物質(zhì)的特性2大多數(shù)情況下，大腸桿菌結(jié)構(gòu)基因在基因組中是單拷貝的，但編碼rRNA的基因rrn往往是多拷貝的。反映了基因組經(jīng)濟而有效的結(jié)構(gòu)。大腸桿菌有7個rRNA操縱子，其特征都與基因組的復(fù)制方向有關(guān)即按復(fù)制方向表達。其中6個分布在DNA的雙向復(fù)制起點oric(83min處)附近，而不是在復(fù)制終點（33min）附近。復(fù)制起點處基因表達量幾乎是復(fù)制終點同樣基因的2倍，這有利于核糖體的快速組裝，便于在急需蛋白質(zhì)合成時細胞可以在短時間內(nèi)有大量的核糖體生成?；蚪M的重復(fù)序列少而短。原核生物基因組有一定數(shù)量的重復(fù)序列，但比真核生物少得多，且重復(fù)序列短，一般位4～40bp。重復(fù)程度有的為10多次，多者達上1000次。大腸桿菌K12菌株的染色體物理圖譜古菌的遺傳特性1

古細菌詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannaschii）分離自2600m深,2.63x107Pa(260大氣壓)，94oC的海底火山口附近。此菌的基因組全序列分析表明，幾乎有一半的基因在現(xiàn)有的細菌和真菌基因數(shù)據(jù)庫中找不到同源序列，只有40%左右的基因與其他二域生物具有同源性，其中有的類似于真細菌，有的類似于真核生物，有的就是兩者的融合，是真細菌和真核生物特征的一種奇異結(jié)合體。古細菌基因組在結(jié)構(gòu)上類似于細菌。胞內(nèi)16SrRNA的堿基序列既不同于真細菌的16SrRNA堿基序列，也不同于真核生物。古菌具有特殊的與細菌不同而與真核生物相類似的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，此系統(tǒng)不受利福平等抗生素抑制，且RNA聚合酶由多個亞基組成，核糖體30S亞單位的形狀、tRNA結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)合成的起始氨基酸，對各種抗生素的敏感性等都不同于細菌而類似于真核生物。古菌的遺傳特性2

詹氏甲烷球菌環(huán)形染色體DNA大小為1.66x106bp,具有1682個編碼蛋白質(zhì)的ORF。功能相關(guān)的基因組成操縱子結(jié)構(gòu)，共轉(zhuǎn)錄成一個多順反子；有2個rRNA操縱子；有37個tRNA基因，基本上無內(nèi)含子；無核膜。但負責信息傳遞功能的基因（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯）則類似于真核生物，特別是轉(zhuǎn)錄起始系統(tǒng)與真核生物基本相同，而與細菌絕然不同。古細菌的RNA聚合酶在亞基組成和亞基序列上類同于真核生物的RNA聚合酶II和III,而不同于細菌的RNA聚合酶。相應(yīng)的啟動子結(jié)構(gòu)也類同于真核生物，TATA-box序列都位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25-30核苷酸處，與細菌啟動子的典型結(jié)構(gòu)（-10和-35）不一樣。古菌的翻譯延長因子是EF-Ia和EF-2，而細菌中分別為EF-Tu和EF-G，氨酰tRNA合成酶基因，復(fù)制起始因子等均與真核生物相似。古菌另有5個組蛋白基因，其組蛋白的存在可能表明，雖然甲烷球菌基因圖譜看來酷似細菌的基因圖譜，但基因組本身在細胞內(nèi)可能實際上是按典型的真核生物方式組成真正的染色體結(jié)構(gòu)。生命三域的16SrRNA、18SrRNA的特征核苷酸序列特征核苷酸序列

序列位置

在三域的16SrRNA、18SrRNA中出現(xiàn)（%）

概率

細菌域

古菌域

真核生物域CACYYG315>9500CYAAYUNYG510>9500AAACUCAAA91010030AAACUUAAAG9100100100NUUAAUUCG960>9500YUYAAUUG960<1100100CAACCYYCR1110>9500UUCCCG1380>9500UCCCUG13800>95100CUCCUUG13900>950UACACACCG1400>990100CACACACCG140001000Y：任一嘧啶，R：任一嘌呤，N：任一嘌呤或嘧啶酵母菌的遺傳特性

酵母是單細胞真核生物，已完成全基因組測序，基因組大小13.5x106bp，分布在16個不連續(xù)的染色體中。DNA與4種主要的組蛋白(H2A，H2B，H3和H4)結(jié)合成染色質(zhì)(chromatin)的14bp核小體核心DNA，染色體DNA上有著絲粒(centromere)和端粒(telomere)，沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)，有間隔區(qū)或內(nèi)含子序列。最顯著的特點是高度重復(fù)，如tRNA基因在每個染色體上至少4個，多則30多個，共約有250個拷貝?；蚪M上有許多較高同源性的DNA重復(fù)序列，這是一種進化。即可在少數(shù)基因發(fā)生突變而失去功能時不會影響生命過程，也可適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境，豐余的基因可在不同的環(huán)境種起用多個功能相同或相似的基因產(chǎn)物，有備無患。酵母菌確實比細菌和病毒進步而富有，而細菌和病毒似乎更聰明，能更經(jīng)濟更有效地利用遺傳資源?；蛲蛔円?、突變類型依據(jù)表型改變分為：1、形態(tài)突變型：發(fā)生細胞形態(tài)變化或引起菌落形態(tài)改變的突變型。2、生化突變型：一類發(fā)生代謝途徑變異但無明顯形態(tài)變化的突變型。3、致死突變型：造成個體死亡或生活力下降的突變型，后者稱為半致死突變型。4、條件致死突變型：在某一條件下具致死效應(yīng)，而在另一條件下無致死效應(yīng)的突變型。生化突變型分類

1、營養(yǎng)突變型：由基因突變而引起代謝過程中某酶合成能力喪失的突變型，它們必須在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長。2、抗性突變型：一類能抵抗有害理化因素的突變型。根據(jù)其抵抗對象可分為抗藥性、抗紫外線或抗噬菌體等突變類型。3、抗原突變型：指細胞成分尤其是細胞表面成分（細胞壁、莢膜、鞭毛）的細微變異而引起抗原性變化的突變型。突變的其他分類類型

依遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，分為：堿基置換，移碼，DNA片段的缺失和插入

依突變引起的遺傳信息的改變分為：同義突變，錯義突變和無義突變第二節(jié)基因工程基因工程I基因工程是一種DNA的體外重組技術(shù)，是根據(jù)人們的需要，在分子水平上用人工方法取得供體DNA上的基因，在體外重組于載體DNA上，再移入原體細胞，使轉(zhuǎn)錄翻譯及復(fù)制，表達出供體基因原有的生物學特性。

基因工程II這種使DNA分子進行重組，再在受體細胞內(nèi)無性繁殖的技術(shù)也被稱為分子無性繁殖或分子克隆。通過基因工程改造后的菌株被稱為“工程菌”。基因工程主要步驟①分離或合成基因；②體外重組將基因插入載體；③重組DNA導(dǎo)入受體細胞；④基因克隆和篩選重組子；⑤克隆的基因進行鑒定或測序；⑥外源基因的表達和基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因微生物、轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物的獲得?；蚬こ痰幕静僮鞑襟E21、目的基因的取得2、載體的選擇3、目的基因與載體DNA的體外重組4、重組載體引入受體細胞

基因工程的操作步驟示意圖目的基因的取得1）從適當?shù)墓w細胞的DNA中分離。2）通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA合成cDNA。3）由化學方法合成特定功能的基因。一、微生物基因工程的工具酶

對DNA片段進行操作，必須要運用能“切短”DNA的得心應(yīng)手的工具。工具酶就是對不同來源的DNA片段進行切割拼接組裝。在分離目的基因或切割載體時，需利用特異的限制性核酸內(nèi)切酶對DNA進行準確切割。在構(gòu)建重組DNA時，需要DNA連接酶催化，使目的DNA片段與載體DNA進行連接。1、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）或簡稱為限制性酶（restrictionenzyme）是指能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類

限制性核酸內(nèi)切酶可分成三類：I類酶結(jié)合于識別位點并隨機切割識別位點不遠處的DNA。III類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底物上解離。以上二類酶兼有切割和修飾（甲基化）的作用，并依賴于ATP的存在。II類酶由二種酶組成，一種為限制性內(nèi)切核酸酶，它切割某一特異的核苷酸序列；另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。至今已分離出600多種II類酶。限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的作用

2、DNA連接酶將不同的DNA片段連接在一起的酶叫DNA連接酶。DNA連接酶主要來自T4噬菌體和大腸桿菌。DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸二酯鍵。它既能催化雙鏈DNA中單鏈切口的封閉，也能催化兩個雙鏈DNA片段進行連接。DNA連接酶主要有兩種：一種是T4DNA連接酶，另一種是大腸桿菌DNA連接酶。T4DNA連接酶由一條多肽鏈組成，相對分子量為6800Da，通常催化粘性末端間的連接效率要比催化平末端連接效率為高。催化反應(yīng)需要Mg2+和ATP，ATP作為反應(yīng)的能量來源。T4DNA連接酶在基因工程操作中被廣泛應(yīng)用。大腸桿菌DNA連接酶的相對分子量為7500Da，連接反應(yīng)的能量來源是NAD+，此酶催化DNA連接反應(yīng)與T4DNA連接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端連接。體外DNA連接方法目前常用的三種：1）用T4或E.coliDNA連接酶可連接具有互補粘性末端的DNA片段；2）用T4DNA連接酶連接具有平末端DNA片段；3）先在DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，然后再進行連接。二、微生物基因克隆載體克隆載體（cloningvector）是把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體（vector）。作為克隆載體的基本要求：①

能進行獨立自主復(fù)制；②

具有便于外源DNA的插入和限制酶作用的單一切割位點；③

必須具有可供選擇的遺傳標記，例如具有對抗生素的抗性基因，便于對陽性克隆的鑒別和篩選?；蚬こ讨惺褂玫妮d體基本上均來自微生物，主要包括6大類：質(zhì)粒載體；λ噬菌體載體；柯斯質(zhì)粒載體；M13噬菌體載體；真核細胞的克隆載體；人工染色體等。載體的選擇I1）是一個有自我復(fù)制能力的復(fù)制子（replicon)2)能在受體細胞內(nèi)大量增殖，即有較高的復(fù)制率。3）載體上最好只有一個限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上。4）載體上必須有一種選擇遺傳標記，以便及時將“工程菌”選擇出來。載體的選擇II有條件作為載體的，對原核受體細胞來說，主要有細菌質(zhì)粒（松弛型）和λ噬菌體兩類對真核微生物受體來說，主要有SV4O病毒SV4O病毒是猴體內(nèi)小型環(huán)狀雙鏈DNA病毒對植物細胞受體來說，主要是Ti質(zhì)粒第三節(jié)微生物酶學工程MicrobialEnzymologicalEngineering酶學工程酶學工程（enzymeengineering）是指從細胞和分子水平上對酶進行改造和加工，使酶最大限度地發(fā)揮其效率的過程。

一、酶的分離純化對酶分子進行改造和加工，首先必須對酶進行分離純化。分離：對胞內(nèi)酶，先破碎細胞，然后用稀酸、稀堿或稀鹽溶液將酶抽提出來，對胞外酶，用離心或過濾等方法去除沉淀物。純化：這些抽提液或培養(yǎng)液經(jīng)濃縮后，用層析、離心、凝膠過濾等方法純化。由于酶很容易失活，操作時應(yīng)盡可能溫和，最好在低溫（0℃~4oC）下進行。二、酶的分子改造由于酶是生物細胞產(chǎn)生的，因此其最適作用條件常常是常溫、中性pH范圍。但是在應(yīng)用酶時，常是在體外的各種環(huán)境中，而這些環(huán)境常會引起酶的不穩(wěn)定。即酶的產(chǎn)生條件與作用條件不一致。為此，需要對酶分子進行改造，使其能適應(yīng)多方面的需要。對酶分子的改造一般有以下兩種方法：1、分子修飾2、生物酶工程

1、分子修飾通過對主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學修飾來改造酶分子，如水解去除酶的部分非活性主鏈，利用修飾劑對酶分子上的某些側(cè)鏈基團（盡可能選擇非必需基團）進行共價修飾，輔酶因子的置換等，以提高酶活力，改進酶的穩(wěn)定性和對環(huán)境的適應(yīng)性。

2、生物酶工程通過遺傳工程手段改造編碼酶分子的基因從而達到改變酶分子的目的?？砂ㄈ齻€方面內(nèi)容：①

用基因工程技術(shù)生產(chǎn)克隆酶－－酶的克隆是指用基因工程的方法將酶編碼基因克隆至微生物受體中，使其在微生物中高效表達，并通過發(fā)酵大量生產(chǎn)的一種技術(shù)。②

修飾酶基因——酶基因的修飾是通過定向誘變改變基因的某幾個堿基，使其編碼的酶的部分氨基酸發(fā)生變化，從而改進酶性狀的一種技術(shù)。③

設(shè)計出新酶基因，合成自然界中從未有過的酶。三、酶與細胞的固定化

酶是一種生物催化劑，穩(wěn)定性較差，而且催化結(jié)束后難于收回。為此發(fā)展出了固定化技術(shù)。即用物理或化學方法將酶（或細胞）固定于某一限制性空間，并保持其固有的催化活性，使其活性能被反復(fù)利用的技術(shù)。尤其是對多酶反應(yīng)體系來說，直接用固定化細胞可能更方便、更經(jīng)濟。

固定化方法1常用的制備方法有：載體結(jié)合法，交聯(lián)法和包埋法等幾大類。載體結(jié)合法是將酶或細胞通過物理吸附、離子吸附、螯合和共價結(jié)合等方式連接到載體上的固定化技術(shù)；交鏈法是通過雙功能或多功能的交聯(lián)劑，使酶或細胞與載體間形成共價結(jié)合的一種固定化技術(shù)包埋法是通過高分子凝膠網(wǎng)格或半透膜將酶或細胞固定的技術(shù)。固定化的細胞具有明顯的特點：①

酶活力的穩(wěn)定性增強；②

酶促效率明顯升高；③

具有多步酶反應(yīng)的特點；④

反應(yīng)時不需添加輔助因子；⑤

細胞透性增強；⑥

熱穩(wěn)定性增強；⑦

易產(chǎn)生副反應(yīng)。

固定化方法示意圖2（1）離子結(jié)合法（2）共價結(jié)合法（3）交聯(lián)法（4）聚合物包埋法（5）微膠囊法四、生物傳感器

由于固定化酶或細胞具有穩(wěn)定性好，能重復(fù)利用的優(yōu)點，人們將它與化學或物理元件組裝在一起，利用其催化特性來分析樣品中的有機物質(zhì)（酶的底物）。這種由生物學、醫(yī)學、電化學、光學、熱學等多學科相互滲透而成長起來的分析檢測裝置就是生物傳感器，它具有選擇性高、分析速度快、操作簡單、價格低廉等特點，能進行連續(xù)在線分析。

將酶、細胞，甚至細胞器、組織或抗體固定于透性膜上構(gòu)成生物敏感膜。待測物質(zhì)經(jīng)擴散作用進入生物膜層，經(jīng)分子識別，發(fā)生特異性的生化反應(yīng)，產(chǎn)生的信號繼而被相應(yīng)的化學或物理換能器轉(zhuǎn)換成可定量、可處理的電信號，再經(jīng)放大輸出，就可從儀表上讀取待測物的濃度。五、蛋白質(zhì)工程

通過修飾基因的