流式細(xì)胞術(shù)課件

流式細(xì)胞儀介紹

Tohelpallpeoplelivehealthylives流式細(xì)胞術(shù)－歷史回顧1973年BD推出世界第一臺(tái)流式細(xì)胞儀 FACSI（FluorescenceActivatedCellSorter）1980年中國(guó)的第一臺(tái)流式細(xì)胞儀FACSII生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域FACS流式細(xì)胞儀市場(chǎng)占有率：全球75%，中國(guó)70%，F(xiàn)ACSAria

市場(chǎng)占有率達(dá)到90％。流式細(xì)胞術(shù)定義：在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞或顆粒的多項(xiàng)理化及功能性指標(biāo)的一種分析技術(shù)特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析檢測(cè)的樣本種類多樣：前提－單細(xì)胞懸液外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，腹水，實(shí)體組織（腫瘤、腺體、淋巴結(jié)），培養(yǎng)細(xì)胞流式分選：以流動(dòng)狀態(tài)的單個(gè)細(xì)胞的各項(xiàng)特性進(jìn)行細(xì)胞分離流式檢測(cè)原理通過(guò)激光激發(fā)高速流動(dòng)的單個(gè)細(xì)胞所攜帶的各種熒光素和熒光染料，并檢測(cè)由此產(chǎn)生的散射光和熒光的發(fā)射光，通過(guò)各種光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)反應(yīng)細(xì)胞的各種特征。流式細(xì)胞儀的分類臺(tái)式機(jī)型臨床型：FACSCalibur，F(xiàn)ACSCanto，F(xiàn)ACSCount科研型:LSRⅡ，F(xiàn)ACSAria，F(xiàn)ACSArray非臺(tái)式機(jī)型:FACSVantageSE，F(xiàn)ACSDiVa流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)：將待測(cè)樣本按一定的速度一個(gè)個(gè)通過(guò)檢測(cè)區(qū)光學(xué)系統(tǒng)：產(chǎn)生并收集散射光和熒光信號(hào)電子系統(tǒng)：光學(xué)信號(hào)處理和顯示液流系統(tǒng)－樣本流細(xì)胞或微粒的懸浮液通過(guò)50－300um的小孔引入鞘液，使得細(xì)胞或微粒單個(gè)單個(gè)流經(jīng)檢測(cè)區(qū)FALSSensor90LSSensorLaser樣本細(xì)胞的大小

0.5-40微米液流系統(tǒng)－鞘液當(dāng)液流系統(tǒng)符合雷諾茲公式時(shí)，樣品流能保持在液流的中心區(qū)流動(dòng)而不和鞘液混合，即形成層流雷諾茲公式（Reynoldsnumber）當(dāng)Re<2300,液流可以一直保持層流當(dāng)

Re>2300,將會(huì)發(fā)生湍流流體動(dòng)力學(xué)的聚焦效應(yīng)（HydrodynamicFocusing）：大量的鞘液流包裹少量的樣本流，并對(duì)樣本流在中軸位置具有聚焦的作用液流系統(tǒng)－壓力系統(tǒng)液流系統(tǒng)－壓力系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)－光源光束需和細(xì)胞或微粒在檢測(cè)區(qū)正交特定的熒光染料需要特定波長(zhǎng)的激發(fā)光源兩類激發(fā)光源：激光器：易聚焦成高能量的分布的光斑，弧光燈：光束散交，能量低，位置和功率閃爍，光學(xué)系統(tǒng)－散射光信號(hào)前向角散射光（FSC):和細(xì)胞或待測(cè)顆粒的大小和表面積有關(guān)可以用來(lái)區(qū)分死/活細(xì)胞側(cè)向角散射光（SSC):和細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和顆粒性有關(guān)可以用來(lái)區(qū)分粒/非粒細(xì)胞光學(xué)系統(tǒng)－散射光信號(hào)散射光可以用來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞群體的最基本的形態(tài)差異

- 常常用散點(diǎn)圖“DotPlots”來(lái)顯示

- 圖上的每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)信息DotPlot(lysedwholeblood)光學(xué)系統(tǒng)--熒光信號(hào)細(xì)胞標(biāo)記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長(zhǎng)的激發(fā)光來(lái)激發(fā)熒光強(qiáng)度是和細(xì)胞上標(biāo)記上的熒光染料的量正相關(guān)熒光在90°角的方向上檢測(cè)熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來(lái)接收特定檢測(cè)是通過(guò)光學(xué)濾片和透鏡來(lái)控制的熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)FL1=FITC+x%PEFL2=PE+y%FITC熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2(0–30%)(0–1%)如何進(jìn)行補(bǔ)償？1、選擇補(bǔ)償管用的細(xì)胞，一定要含有補(bǔ)償用的抗體陽(yáng)性和陰性的細(xì)胞群，陽(yáng)性群體的熒光并盡可能強(qiáng)。2、染色同型對(duì)照，調(diào)節(jié)電壓盡可能高，一定要能看到完整的陰性細(xì)胞群，大一點(diǎn)的沒(méi)有太大關(guān)系。3、選擇細(xì)胞群中自發(fā)熒光相同的細(xì)胞群進(jìn)行分析（例如外周血可選擇淋巴細(xì)胞）。光學(xué)系統(tǒng)－光學(xué)濾片長(zhǎng)通濾光片只容許某一波長(zhǎng)之上的光通過(guò)短通濾光片容許某一波長(zhǎng)之下的光通過(guò)帶通濾光片容許某一波長(zhǎng)的上下一個(gè)極小范圍內(nèi)的光通，帶寬可以特定化二向色性當(dāng)濾光片和光源成45度角的方向放置，原本被通過(guò)的光照樣通過(guò)，而原本會(huì)被封鎖的光將會(huì)沿著90度角的方向被反射出去LONG(700nm)550LongPass650ShortPassSHORT(500nm)PassThroughFilters600/100BandPassTransmitted<650nm>550nm550-650nm(600±50)WavelengthsBlocked>650nm<550nm<550nm&>650nmShortPassLongPassBandPassLONG(700nm)550LongPass650ShortPassSHORT(500nm)Dichroic

FiltersTransmitted<650nm>550nmDiflected90°>650nm<550nm單激光光學(xué)平臺(tái)光電二極管檢測(cè)區(qū)高感度PMTs氬離子激光器光學(xué)系統(tǒng)－熒光監(jiān)測(cè)器兩種常見(jiàn)的熒光監(jiān)測(cè)器光電二級(jí)管:用于強(qiáng)信號(hào)的探測(cè)(如,前向散射光探測(cè)器)光電倍增管(PMT):比光電二極管更敏感但太強(qiáng)的光會(huì)對(duì)其造成破壞有最適的波長(zhǎng)檢測(cè)范圍電子系統(tǒng)－數(shù)據(jù)的采集和處理對(duì)探測(cè)器檢測(cè)到的信號(hào)加以處理前置放大在從遠(yuǎn)處的探測(cè)器傳到中央電子系統(tǒng)前對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大放大調(diào)節(jié)信號(hào)的強(qiáng)度線性的或?qū)?shù)的放大計(jì)算脈沖信號(hào)的積分，高度或?qū)挾葧r(shí)間調(diào)整多參數(shù)檢測(cè)時(shí)所必須的數(shù)模轉(zhuǎn)換流式細(xì)胞儀的分選功能對(duì)細(xì)胞或其他微粒的懸液中我們所感興趣的部分用具有分選功能的流式細(xì)胞儀將之分選出來(lái)兩種分選方式機(jī)械式：FACSCalibur帶電式：FACSAria流式細(xì)胞儀的分選功能對(duì)細(xì)胞或其他微粒的懸液中我們所感興趣的部分用具有分選功能的流式細(xì)胞儀將之分選出來(lái)兩種分選方式機(jī)械式：FACSCalibur檢測(cè)點(diǎn)后裝有一機(jī)械裝置捕獲所需要的細(xì)胞一旦檢測(cè)到所需要的細(xì)胞捕獲裝置就會(huì)移動(dòng)到核心樣本流處細(xì)胞被捕獲轉(zhuǎn)移到收集容器中然后捕獲裝置又離開(kāi)核心樣本流回復(fù)到原始位置帶電式：FACSAria回顧液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)細(xì)胞周期及倍體分析倍體分析原理細(xì)胞增殖周期：分為G0、G1、S、G2、M期。G0/G1期細(xì)胞為二倍體細(xì)胞，其DNA含量用2N表示，G2/M期為四倍體細(xì)胞，其DNA含量用4N表示，S期細(xì)胞DNA含量介于此兩者之間。利用熒光染料如PI（Propidiumiodide）與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，結(jié)合量多少可反映細(xì)胞內(nèi)DNA含量。FCM分析一個(gè)群體細(xì)胞峰DNA倍體與細(xì)胞周期時(shí)，將DNA含量直方圖分為三部分，即G0/G1,S,G2/M期三個(gè)細(xì)胞峰。G0/G1和G2/M細(xì)胞峰DNA的含量成正態(tài)分布，S期細(xì)胞峰則是一個(gè)加寬的正態(tài)分布。細(xì)胞周期示意圖及DNA含量直方圖細(xì)胞周期示意圖及DNA含量直方圖熒光信號(hào)的面積一般對(duì)DNA倍體測(cè)量時(shí)采用面積（如FL2-A），這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量，當(dāng)形狀差異較大，而DNA含量相等的二個(gè)細(xì)胞，得到的熒光脈沖高度是不等的，經(jīng)過(guò)對(duì)熒光信號(hào)積分后，所得到的信號(hào)值就相等。寬度FL2-WFL2-W常用來(lái)區(qū)分雙聯(lián)體細(xì)胞，由于DNA樣本極容易聚集，當(dāng)兩個(gè)G1期細(xì)胞粘連在一起時(shí)，其測(cè)量到的DNA熒光信號(hào)（FL2-A）與G2期細(xì)胞相等，這樣得到的測(cè)量數(shù)據(jù)G2期細(xì)胞比例會(huì)增高，影響測(cè)量準(zhǔn)確性幾個(gè)概念DNA指數(shù)(DI)：通過(guò)比較G0/G1期細(xì)胞峰位置的變化顯示，為

測(cè)量樣本G0/G1期DNA熒光通道數(shù)與正常人淋巴細(xì)胞G0/G1期DNA熒光通道數(shù)比值。CV值：變異系數(shù)，由于儀器及實(shí)驗(yàn)樣本的影響，測(cè)定過(guò)程中存在的漂移現(xiàn)象，其包括兩部分，即反應(yīng)儀器精密度的CV值及實(shí)驗(yàn)樣本的CV值。細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)凋亡與壞死凋亡---細(xì)胞主動(dòng)參與自身死亡的過(guò)程。凋亡程序有一些特殊形態(tài)學(xué)特征，包括質(zhì)膜的改變，如細(xì)胞膜不對(duì)稱性和細(xì)胞附著消失，胞漿和細(xì)胞核固縮，核內(nèi)DNA裂解。到了晚期，凋亡細(xì)胞斷裂成“凋亡小體”，并很快被巨噬細(xì)胞清除，而不會(huì)引起周圍細(xì)胞的炎癥損傷壞死---通常是由細(xì)胞損傷或細(xì)胞毒物作用引起，在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞生物特性上，與凋亡有著本質(zhì)的區(qū)別。壞死細(xì)胞的早期變化是細(xì)胞和線粒體腫脹，繼而細(xì)胞膜破壞。不同于凋亡的是，壞死的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)容物（多為蛋白水解酶）釋放，會(huì)引起周圍組織的炎癥反應(yīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

細(xì)胞凋亡檢測(cè)的常用手段主要分為形態(tài)學(xué)檢查、分子生物學(xué)方法、免疫電泳法和細(xì)胞學(xué)檢查。其中，用流式細(xì)胞術(shù)研究細(xì)胞凋亡在技術(shù)和應(yīng)用領(lǐng)域方面應(yīng)用日益廣泛。由于可以對(duì)凋亡的多種特征進(jìn)行快速、靈敏、特異的定性分析和定量分析，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為凋亡分析的重要檢測(cè)手段。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞形態(tài)的變化細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻導(dǎo)致的細(xì)胞膜不對(duì)稱性消失線粒體膜電位的改變蛋白水解酶——Caspase酶的活化核酸內(nèi)切酶活化導(dǎo)致的DNA斷裂凋亡峰的檢測(cè)細(xì)胞散射光變化在細(xì)胞凋亡的初始階段，細(xì)胞膜發(fā)生皺縮，導(dǎo)致FSC減小，而SSC增加或者維持不變凋亡峰檢測(cè)：在凋亡細(xì)胞中，利用流式檢測(cè)PI染色后的DNA，可以發(fā)現(xiàn)一個(gè)亞群，稱為A0細(xì)胞，該細(xì)胞DNA染色減少。研究者認(rèn)為DNA染色減少的原因是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)DNA的程序性減少，源于DNA片斷化，而導(dǎo)致小分子量的DNA漏出照成的。凋亡峰檢測(cè)PI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cellsProtocols用70%的乙醇固定細(xì)胞1ml細(xì)胞懸液(1-5X106)均勻,快速混合于10ml預(yù)冷的70%乙醇中,置于4℃冰箱中≥2小時(shí)從細(xì)胞中萃取出小分子量DNA離心收集細(xì)胞,徹底去除乙醇,加入50ulDNA萃取緩沖液置于37℃水浴30分鐘離心細(xì)胞加入1mlPI/RNAse染液,室溫避光孵育30分鐘流式檢測(cè)磷脂酰絲氨酸的翻轉(zhuǎn)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)會(huì)有一系列的形態(tài)學(xué)特征性改變，其中，質(zhì)膜的改變是早期凋亡的特征之一。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）從胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露于細(xì)胞外表面。AnnexinV是一個(gè)35-36kD的Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它與磷脂酰絲