淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選、誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究

淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選、誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究江西師范大學生命科學學院生物工藝組趙喜華淀粉酶概況

淀粉分直鏈和支鏈淀粉。

淀粉酶是水解淀粉一類酶的統(tǒng)稱，能將淀粉水解成糊精等小分子物質并進一步水解成麥芽糖或葡萄糖。

淀粉酶分為α-淀粉酶、淀粉1，4-麥芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（異淀粉酶）等。主要來源于根霉、曲霉、青霉、芽孢等菌屬。淀粉酶的應用實驗內容建立高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌初篩方法建立高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌復篩方法建立淀粉酶酶活測定方法建立高產(chǎn)淀粉酶菌誘變育種方法建立高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化方法實驗目的掌握淀粉酶產(chǎn)生菌初篩方法掌握淀粉酶產(chǎn)生菌復篩方法掌握淀粉酶酶活測定方法掌握紫外誘變育種方法掌握微生物產(chǎn)淀粉酶條件優(yōu)化方法實驗一淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選培養(yǎng)基制備配制肉湯培養(yǎng)基45ml，分裝于250ml三角瓶中，紗布封口，滅菌。配制初篩平板培養(yǎng)基350ml，分裝于500ml三角瓶中，封口膜封口，滅菌。將融化的初篩平板培養(yǎng)基冷卻至50-60℃，以無菌操作法倒至已滅菌的培養(yǎng)皿中，至蓋滿底部。冷卻凝固待用。倒平板取5g土樣接入45ml肉湯培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩15min制成土壤懸液，此時的稀釋度為10-1。另取4支試管，分別記作10-2、10-3、10-4、10-5共5個梯度，每支試管內加入9mL無菌水。

用無菌移液管從三角瓶中吸取1mL土壤懸液，加入到10-2試管中混勻，再從此試管中吸取1mL加入到10-3試管中，依此類推直至10-5試管。樣品預處理

分別從不同稀釋度的試管中吸取0.1ml懸液，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)24-48h。涂布

初篩平板長出菌落后，挑取不同菌落進行編號保存。

將檢測試劑（碘液）加入到平板中，涂布均勻，菌落周圍形成水解圈的菌株，取水解圈大的菌株進行下一步實驗。（本次實驗應有照片及水解圈直徑表格作為結果）初篩初篩結果菌編號菌落直徑（d）透明圈直徑（D）D/d值12345678初篩結果保存菌種將得到的菌株轉接至斜面培養(yǎng)基上（每組轉接2株，每株保存3支），30℃培養(yǎng)48～72h，待菌苔長好后于4℃保存。實驗二高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌復篩及酶活測定功能性平板篩選具有簡便、快速并節(jié)約大量時間等優(yōu)良特性，但難以得到確切產(chǎn)量水平，只適合初篩。

初篩具有不穩(wěn)定性，有必要進行搖瓶復篩，定量確定表達水平，獲得優(yōu)良性狀菌株。高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌的搖瓶復篩誘導培養(yǎng)基配制可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml

接種取斜面，倒入無菌培養(yǎng)基，用無菌接種針打散斜面上的菌苔，再倒回裝有無菌培養(yǎng)基（1%葡萄糖代替可溶性淀粉）的三角瓶中進行培養(yǎng)24小時，以10％接種量接種到誘導培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)48小時。離心

8000r、5min離心發(fā)酵液，取上清液。固液轉接固液轉接固液轉接固液轉接液液接種液液接種液液接種液液接種（250ml，裝液50ml）10%接種量，50ml接5ml30℃培養(yǎng)48h淀粉酶誘導表達葡萄糖標準曲線繪制試管編號1μg/μL葡萄糖標準液體(μL)蒸餾水(μL)DNS(μL)平均OD540110019002000220018002000330017002000440016002000550015002000660014002000DNS法測淀粉酶酶活。將6個試管于沸水中反應10min后迅速冷卻，取2mL反應液再加入4mL蒸餾水，通過比色皿于540nm處測定吸光度。以葡萄糖量（μg）為y軸和吸光度為x軸，再采用origin7.5軟件獲得回歸曲線。淀粉酶酶活測定步驟試管A（空白）試管B↓↓加淀粉液含緩沖液1.5mL加淀粉液含緩沖液1.5mL↓↓取2mLDNS加入0.5mL稀釋粗酶液↓↓40±0.2℃，30min加入0.5mL稀釋粗酶液取2mLDNS↓100℃，10min↓100℃，10min快速冷卻，取2.00ml反應液快速冷卻，取2.00ml反應液↓↓加入4mL水，于540nm測酶活加入4mL水，于540nm測酶活1個酶活力單位的定義（1u/ml）：1ml酶液于40℃和pH6.0條件下每分鐘產(chǎn)生1微克葡萄糖。菌株編號酶活淀粉酶酶活定義酶活實驗數(shù)據(jù)酶活力=[OD值代入標準曲線后得到葡萄糖含量(μg)]×稀釋倍數(shù)÷30min÷0.5mL（本次實驗應有酶活數(shù)據(jù)作為結果）淀粉酶酶活測定獲得淀粉酶高產(chǎn)菌通過搖瓶復篩以及酶活檢測，獲得產(chǎn)酶最高的菌株。以此為研究對象，進行紫外誘變選育實驗，以期獲得產(chǎn)酶更高的突變株。實驗三高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌紫外誘變選育DNA于260nm有最大能量吸收峰，通過與15W紫外燈相距30cm的紫外照射，會吸收大量能量造成DNA分子發(fā)生斷裂、分子結構形式發(fā)生改變。經(jīng)過修復，DNA堿基發(fā)生了改變從而形成了突變株，有些突變株產(chǎn)酶水平提高了（正突變），而有些突變株產(chǎn)酶水平降低了（負突變），再通過功能性平板篩選和復篩獲得目的突變株。1.培養(yǎng)基：葡萄糖2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml2.將出發(fā)菌株從試管中用25mL無菌生理鹽水多次洗出，倒入含有玻璃珠的無菌三角瓶中，進行反復振蕩20min。3.吸出5mL至含有磁針的無菌平皿中，置于磁力攪拌器上，緩慢加速磁力攪拌器。然后打開培養(yǎng)皿蓋，再打開紫外燈迅速記時（在紅光或黑暗條件下進行）。時間到立刻關閉紫外燈（5S、10S、15S、20S、25S、30S、35S、40S）。4.⑴對照：將未進行輻射的菌懸液稀釋適當倍數(shù)10-5，10-6，10-7，涂平皿；⑵處理組：將進行輻射的菌懸液稀釋適當倍數(shù)10-3，10-4，10-5，涂平皿。5.30℃恒溫培養(yǎng)48小時（培養(yǎng)物用黑布袋或報紙包裹嚴實培養(yǎng)）。6.計數(shù)并計算致死率（70%-75%）。產(chǎn)淀粉酶菌株誘變劑量選擇致死率計算對照稀釋倍數(shù)10-510-610-7菌落數(shù)輻照稀釋倍數(shù)10-310-410-5菌落數(shù)致死率（對照菌落數(shù)－輻照菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)正突變株初篩注意：為了消除培養(yǎng)環(huán)境誤差，突變株比透明圈大于原始菌比透明圈25%為正突變，小于25%為負突變，在此±25%之間認為是沒有發(fā)生突變?？扇苄缘矸?g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml功能性平板篩選如實驗二。比透明圈＝透明圈直徑（mm）/菌落直徑（mm）正突變株復篩方法同前，不再重復。保存5株產(chǎn)酶水平最高的突變株。高產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性1.可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml2.取斜面，倒入無菌培養(yǎng)基，用無菌接種針打散斜面上的菌苔，再倒回裝有無菌培養(yǎng)基的三角瓶中進行培養(yǎng)8小時。8小時后以10％接種量進行擴大培養(yǎng)8小時，依次類推至5代。3.離心發(fā)酵液，取上清。4.同前方法測酶活。5.取穩(wěn)定性和酶活都高的正突變株為研究對象。實驗四

淀粉酶生產(chǎn)菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化對象：實驗三獲得的穩(wěn)定性最好的正突變株。

優(yōu)化方案：培養(yǎng)基組份優(yōu)化；發(fā)酵工藝優(yōu)化。1、以黃豆粉、玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏作為培養(yǎng)基的主要影響因素，每一因素設定3個水平，按表3-1配制培養(yǎng)基（W/V）。另加入Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.15%，分裝于250ml三角瓶，每瓶50ml，6層紗布封口，滅菌。以測酶活的培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)液，按照10%的接種量接種。實驗方法組別因素A黃豆粉因素B玉米粉因素C淀粉因素D酵母膏酶活力/(U/ml)113%11%13%10.4%213%22%25%20.6%313%33%37%30.8%425%11%25%30.8%525%22%37%10.4%625%33%13%20.6%737%11%37%20.6%837%22%13%30.8%937%33%25%10.4%2．接種