第2章 實驗室設(shè)備與一般技術(shù)

第二章實驗室設(shè)備和一般技術(shù)

組織培養(yǎng)實驗室的面積大小和裝備程度取決于兩個因素：一是所要進(jìn)行的實驗的性質(zhì)二是所能得到的經(jīng)費的多少

標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實驗室應(yīng)當(dāng)具備設(shè)施1.玻璃器皿、塑料器皿和其他實驗器皿的清洗和貯存；2.培養(yǎng)基的制備、滅菌和貯存；3.植物材料的無菌操作；4.將培養(yǎng)物保持在溫度、光照、可能時還有濕度的可控條件下；5.培養(yǎng)物的觀察。

第一節(jié)實驗室設(shè)計和常用設(shè)備第二節(jié)器皿用具第三節(jié)培養(yǎng)條件

第一節(jié)實驗室設(shè)計和常用設(shè)備一、實驗室設(shè)計洗滌室、準(zhǔn)備室、滅菌室、緩沖室、無菌操作室、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)實驗室、攝影室等分室，另加馴化室、溫室或大棚。當(dāng)規(guī)模小、條件差的情況下，全部工序也可在一間室內(nèi)完成。（一）準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室（又稱化學(xué)實驗室），要求20m2左右，明亮，通風(fēng)。任務(wù)——器皿洗滌，培養(yǎng)基配制、分裝、高壓滅菌，材料預(yù)處理，重蒸餾水的制備等。同時兼顧試管苗出瓶。需安裝一個較大的水池，水泥制作，白瓷磚砌內(nèi)外表面，池底放一張橡膠墊，以減少玻璃器皿的破損。下水道應(yīng)暢通，以免妨礙工作。大型工作臺1-2張，大桌子1-2張。玻璃櫥1-3個，用以放置藥品、培養(yǎng)瓶和物品等。此外還應(yīng)有化學(xué)藥劑，儀器設(shè)備，各種器皿，烘箱、冰箱、天平、酸度計、蒸餾水發(fā)生器或純水發(fā)生器、高壓滅菌器、電爐、不銹鋼鍋、培養(yǎng)基分注器、盆與桶等。（二）緩沖室

為避免進(jìn)出時帶進(jìn)雜菌，無菌室外應(yīng)設(shè)置緩沖室，面積約3m2-5m2。進(jìn)入無菌室前需在緩沖室里換上經(jīng)過滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋，戴上口罩。最好安裝1盞紫外燈，用以滅菌。墻上設(shè)衣帽鉤，門邊擺拖鞋或設(shè)1鞋箱。還應(yīng)安裝1個配電板，其上設(shè)保險絲盒、閘刀開關(guān)、插座以及石英電力時控器等。石英電力時控器是自動開關(guān)燈的設(shè)備，將它和交流接觸器安裝在電路里就可以自動控制每天的光照時數(shù)。（三）無菌操作室簡稱無菌室或接種室，10m2-20m2，具體視生產(chǎn)規(guī)模和超凈工作臺數(shù)量而定。是組培室最關(guān)鍵的部分。門窗要密閉，一般用移動門窗，以減少空氣的擾動。安裝紫外燈空調(diào)操作臺和擱架以放置組培的操作器具和滅菌后待接種的培養(yǎng)瓶等。其主要儀器設(shè)備有：超凈工作臺、空調(diào)機(jī)、醫(yī)用小平車等。

（四）培養(yǎng)室

培養(yǎng)室是將接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料進(jìn)行培養(yǎng)的場所。其面積根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模和經(jīng)濟(jì)條件來確定。為了滿足外植體的生長和發(fā)育，培養(yǎng)室要具備適宜的溫度、濕度、光照、通風(fēng)等條件。其主要設(shè)計如下：培養(yǎng)架子和燈光通風(fēng)設(shè)施邊臺

（五）馴化室當(dāng)試管苗長出一定量的不定根，根長在0.5cm-1cm時，及時移栽馴化。馴化室通常是在溫室的基礎(chǔ)上營建。馴化室要求清潔無菌，配有空調(diào)機(jī)、除濕器、恒溫恒濕控制儀、噴霧器、光照調(diào)節(jié)裝置、通風(fēng)口以及必要的殺菌劑。面積大小視生產(chǎn)規(guī)模定。（六）溫室

為了保證試管苗不分季節(jié)地周年地生產(chǎn)，必須有足夠面積的溫室與之配套。溫室內(nèi)應(yīng)配有溫度控制裝置、通風(fēng)口、噴霧裝置、光照調(diào)節(jié)裝置、殺菌殺蟲工具及相應(yīng)藥劑。二、常用設(shè)備

1．超凈工作臺2．無菌箱3．空調(diào)機(jī)

4．除濕機(jī)5．恒溫箱6．烘箱

7．高壓滅菌器8．冰箱9．天平

10．顯微鏡11．水浴鍋12．搖床

13．轉(zhuǎn)床14．蒸餾水發(fā)生器

15．酸度計16．離心機(jī)1．超凈工作臺2．無菌箱3．空調(diào)機(jī)250C±20C

4．除濕機(jī)：濕度也要求恒定，一般保持70%-

80%，濕度過高易滋長雜菌，濕度過低培養(yǎng)器皿

內(nèi)的培養(yǎng)基會失水變干，從而影響外植體的正

常生長。濕度過高時，可采用小型室內(nèi)除濕機(jī)

除濕，當(dāng)濕度過低時，可采用噴水來增濕。

5．恒溫箱:又稱培養(yǎng)箱，可用于植物原生質(zhì)體和酶制劑的保溫，也用于組織培養(yǎng)材料的保存和暗培養(yǎng)。恒溫箱內(nèi)裝上日光燈，可進(jìn)行溫度和光照實驗。

6．烘箱：可以用80C-100C的溫度，迅速干

燥洗凈后的玻璃器皿。也可以用160C-180C的

溫度，進(jìn)行1h-3h的高溫干燥滅菌。還可用80C

的溫度烘干組織培養(yǎng)植物材料，以測定干物質(zhì)。

7．高壓滅菌器：

是一種密閉良好又可承受高壓的金屬鍋，其上有顯示滅菌器內(nèi)壓力和溫度的表頭。滅菌器上還有排氣孔和安全閥。各種型號的高壓滅菌鍋8．冰箱有普通冰箱、低溫冰箱等。用于在常溫下易變性或失效的試劑和母液的儲藏，細(xì)胞組織和試驗材料的冷凍保藏，以及某些材料的預(yù)處理。

9．天平

包括藥物天平、扭力天平、分析天平和電子天平等。大量元素、糖、瓊脂等的稱量可采用感量為0.1g的藥物天平，微量元素、維生素、激素等的稱量則應(yīng)采用感量為0.0001g的分析天平。有條件的，最好配用感量為0.0001g的電子天平。百分之一天平千分之一天平萬分之一天平10．顯微鏡:包括雙目實體顯微鏡（解剖鏡）、

生物顯微鏡、倒置顯微鏡和電子顯微鏡。顯微鏡

上要求能安裝或帶有照相裝置，以對所需材料進(jìn)

行攝影記錄。有：雙目實體顯微鏡、生物顯微鏡

倒置顯微鏡。

11．水浴鍋:水浴鍋可用于溶解難溶藥品和熔化瓊脂條。12．搖床（振蕩培養(yǎng)機(jī)):在液體培養(yǎng)中為了

改善浸于液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)材料的通氣狀況，

可用搖床來振動容器。

13．轉(zhuǎn)床（旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)）:同樣用于液體培養(yǎng)。由于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)使植物材料交替地處于培養(yǎng)液和空氣中，所以氧氣的供應(yīng)和對營養(yǎng)的利用更好。體視顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡倒置顯微鏡倒置熒光顯微鏡14．蒸餾水發(fā)生器:

制備培養(yǎng)基所用的重蒸餾水，是將蒸餾水再蒸餾一次，使水中不含或少含某些離子。一種是用蒸餾水重新蒸餾，另一種是用自來水連續(xù)蒸餾兩次，以獲得重蒸餾水。此外，還可用純水發(fā)生器將自來水制成純凈的實驗室用水，生產(chǎn)速率可達(dá)到4L/h、15L/h或40L/h（因型號而異）。這種水與“試劑級”水比較，其雜質(zhì)的含量仍然太高，但卻得到了質(zhì)量一致的較好的實驗室用水。15．酸度計用于校正培養(yǎng)基和酶制劑的pH值。半導(dǎo)體小型酸度測定儀，既可在配制培養(yǎng)基時使用，又可在培養(yǎng)過程中測定pH值的變化。

16．離心機(jī)用于分離培養(yǎng)基中的細(xì)胞以及解離細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體。一般每分鐘3000-4000轉(zhuǎn)即可。第二節(jié)器皿用具一、組培器皿（一）器皿的類型培養(yǎng)器皿分注器離心管刻度移液管細(xì)菌過濾器1．培養(yǎng)器皿

（1）概念

培養(yǎng)器皿---指用于盛放培養(yǎng)基和接種培養(yǎng)材料的器皿。要求透光度好，能耐高壓滅菌。（2）類型按材料分：

玻璃培養(yǎng)器皿：優(yōu)點是透光度好、容易清洗；缺點是容易破碎；塑料培養(yǎng)器皿：優(yōu)點是不容易破碎、成本較低，但缺點是透光度較玻璃的差、遇火焰易被熔化。按形狀分試管——特別適合于用少量培養(yǎng)基及試驗各種不同配方時選用，在莖尖培養(yǎng)及花藥和單子葉植物分化長苗培養(yǎng)時更顯方便。有圓底的和平底的兩種。三角瓶——是植物組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)器皿，適合于各種培養(yǎng)，固體或液體、大規(guī)模或小規(guī)模都行。其優(yōu)點是：采光好、瓶口較小不易失水和污染。L形管和T形管——為專用的旋轉(zhuǎn)式液體培養(yǎng)試管。培養(yǎng)皿——適于作單細(xì)胞的固體平板培養(yǎng)、胚和花藥培養(yǎng)和無菌發(fā)芽。角形培養(yǎng)瓶和圓形培養(yǎng)瓶——適于液體培養(yǎng)用。果醬瓶——常用于試管苗大量繁殖，200ml-500ml規(guī)格2．分注器

作用---分裝培養(yǎng)基。分注器可以把配置好的培養(yǎng)基按一定量注入到培養(yǎng)器皿中。一般由4cm-6cm的大型滴管、漏斗、橡皮管及鐵夾組成。還有量筒式的分注器，上有刻度，便于控制。微量分注還可采用注射器。3．離心管

離心管用于離心，將培養(yǎng)的細(xì)胞或制備的原生質(zhì)體從培養(yǎng)基中分離出來，并進(jìn)行收集。4．刻度移液管在配制培養(yǎng)基時，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和微量元素等溶液，用量很少，只有用相應(yīng)刻度的移液管才能準(zhǔn)確量取。同時，不同種類的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，不能混淆，這就要求專管專用。常用的移液管容量有0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml、5ml、10ml等。移液器

培養(yǎng)基中有些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)以及有機(jī)附加物質(zhì)如吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）等，在高溫條件下易被分解破壞，而用細(xì)菌過濾器（圖1—7）既可除菌又可保持試劑的功效?？捎媒饘僦频牟淌铰┒?，以石棉濾膜來除去細(xì)菌。在過濾少量的液體時，宜用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合物制成的微孔濾膜，其孔徑為0.45μm。在過濾時需要一套減壓吸濾設(shè)備（通常使用真空泵），漏斗下接吸濾瓶，吸嘴處接上一只內(nèi)裝脫脂棉的濾氣玻璃管。5．細(xì)菌過濾器圖1—7細(xì)菌過濾器滅菌裝置（二）器皿的清洗

植物組織培養(yǎng)除了要對待培養(yǎng)的實驗材料和接種用具進(jìn)行嚴(yán)格消毒外，各種培養(yǎng)器皿也要求洗滌清潔，以防止帶入一些有毒的或影響培養(yǎng)效果的化學(xué)物質(zhì)或一些微生物等，對那些常用的玻璃器皿的清潔程度要求更為嚴(yán)格。

1．洗滌劑——清洗玻璃器皿用的洗滌劑主要有肥皂、洗潔精、洗衣粉和鉻酸洗滌液（由重鉻酸鉀和濃硫酸混合而成）。配制鉻酸洗滌液的注意事項：

（1）在配制時重鉻酸鉀一定要冷卻后才能加濃硫酸，且只能把濃硫酸緩慢加入重鉻酸鉀溶液中，決不能將重鉻酸鉀溶液或蒸餾水倒入濃硫酸中。（2）由于鉻酸洗滌液具有極強(qiáng)的氧化能力和腐蝕作用，故不要用手直接接觸洗滌液。

2．洗滌方法

使用前先用1%稀鹽酸浸泡1夜，然后用肥皂水洗凈，清水沖洗，最后用蒸餾水沖淋1遍，干后備用。

已用過的玻璃器皿洗滌方法：去殘渣——水洗——熱肥皂水（或洗潔精）——水洗——蒸餾水沖洗1次。較臟的玻璃器皿的洗滌：洗衣粉或洗潔精刷洗幾次并沖凈——浸入洗滌液中——流水中沖洗——蒸餾水沖洗。已被霉菌等雜菌污染的玻璃器皿的洗滌：

121℃高溫高壓蒸汽滅菌30min——趁熱倒去殘渣——清水中沖洗——浸泡在濃的重鉻酸鉀洗滌液中——2h后取出——水洗數(shù)次——蒸餾水沖淋1次。

用過的吸管和滴管的清洗：洗滌液中浸泡2h以上——取出在流水中沖洗半小時——蒸餾水沖淋1次。用過的載玻片和蓋玻片的清洗:洗滌液中浸泡數(shù)小時——水洗——綢布擦干——放在95%的灑精中備用?？傊?，要求洗凈的玻璃器皿應(yīng)透明發(fā)亮，內(nèi)外壁水膜均勻，不持水珠。二、器械用具

組織培養(yǎng)所需要的器械用具，可選用醫(yī)療器械和微生物實驗所用的器具。常用的器械用具如圖1—8所示。

鑷子

尖頭鑷子，適用于取植物組織和分離莖尖、葉片表皮等。長20cm-25cm的槍形鑷子，可用于接種和轉(zhuǎn)移植物材料。剪刀

常用的有解剖剪和彎頭剪，一般在轉(zhuǎn)移植株時用。解剖刀

常用的解剖刀，有長柄和短柄兩種。刀片也有雙面及單面之分，可以經(jīng)常更換。對大型材料如塊莖、塊根等就需用大型解剖刀。4.顯微接種工具

包括接種針、接種鉤及接種鏟，由白金絲或鎳絲制成，用來接種花藥或轉(zhuǎn)移植物組織。5.鉆孔器

取肉質(zhì)莖、塊莖、鏡肉質(zhì)根內(nèi)部的組織時使用。鉆孔器一般做成T形，口徑有各種規(guī)格6.其它

燃燒工具用的酒精燈、用于熔解培養(yǎng)基的帶有磁攪拌器的電爐、用于加速熔解瓊脂培養(yǎng)基的微波烘箱、用于貯備無離子水和重蒸餾水的大型塑料桶、試管架以及轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶、試管架的搪瓷盤或塑料框等。

1—8植物組織培養(yǎng)中常用的器械

1．鑷子2．剪刀3．解剖刀4．接種針和接種鉤第三節(jié)培養(yǎng)條件在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。3.1溫度

因為溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，所以植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23～27℃、之間進(jìn)行，一般采用25土2℃。低于15℃時培養(yǎng)，植物組織會表現(xiàn)生長停止，高于35℃時對植物生長不利。

不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同。3.2光照

組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時間方面3.2.1光照強(qiáng)度

光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對外植體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長。3.2.2光質(zhì)

光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。3.2.3光周期

試管苗培養(yǎng)時要選用一定的光周期來進(jìn)行組織培養(yǎng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。

3.3濕度

包括:培養(yǎng)容器濕度

環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，也會導(dǎo)致植物生長發(fā)育受影響。

環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70％-80％的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。濕度過低：會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。

濕度過高時：易引起棉塞長霉，造成污染。

合適的環(huán)境濕度3.4滲透壓

培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1～2個大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，5～6個大氣壓植物生長就會完全停止，6個大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。

3.5pH值

不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的種類最適pH值種類最適pH值