第13章、生物活性測定技術

第三部分鑒定技術生物活性分子的分離與表征第10章、電泳技術第11章、定量分析技術第12章、組分分析技術第13章、生物活性測定技術第13章、生物活性測定技術13.1、概述13.2、酶最適反應條件的測定13.3、酶動力學參數(shù)的測定13.4、酶促反應的影響因素13.5、實例

在酶的分離純化、性質研究以及酶制劑的生產(chǎn)和應用時，都要遇到對酶的活性、純度及含量進行經(jīng)常的、大量的測定工作，這是必不可少的指標。

要研究某種酶，首先必須建立起該酶活性的測定方法。酶活性是指酶催化一定化學反應的能力，檢查酶的含量及存在，通常是用該酶在一定條件下催化某一特定反應的速度，即酶的活性來表示。

13.1、概述一、酶活性單位

酶活性指的是酶制劑催化能力的大小，它既與酶分子的濃度（量）有關，又與酶分子催化能力的大?。ㄙ|）有關。人們規(guī)定一定的催化能力為一個酶活性單位。液體酶制劑的酶濃度用單位體積酶制劑所含的酶活性單位來表示，即u/ml。對于固體狀態(tài)的酶制劑，其酶含量可用單位質量酶制劑所含的酶活性單位來表示，即u/mg。國際酶活性單位1961年，國際酶學會議為酶活性單位規(guī)定了一個統(tǒng)一的標準，即在特定的條件下（一般為酶催化反應的最適條件），1分鐘轉化1μmol底物，或轉化1μN底物有關基團所需的酶量為1個國際單位（IU）。比活性

酶的純度往往用比活性來表示，比活性是用同一酶制劑的酶活性除以蛋白質的質量，即單位質量蛋白質所具有的酶活性，常用的單位為u/mgprotein。酶制劑的比活性越高說明酶的純度越高。二、酶活性測定的主要方法

溫度、pH、離子強度（I=(1/2)ΣCZ2）等因素對酶活性有很大的影響，測定酶活性時一般采用最適環(huán)境條件。若酶催化反應時需要輔助因子，應加入最適量的輔助因子。底物濃度應采用零級反應時的底物濃度，這時反應速度只與酶濃度有關，而與底物濃度無關。隨著反應的進行，產(chǎn)物濃度越來越高，而底物濃度越來越低，導致反應速度下降，所以測酶活性時應測反應的初速度，即反應開始后較短一段時間內的反應速度（反應了的底物不超過5%）。

1

分光光度法（spectrophotometry）

硝酸還原酶將NO3－

還原成NO2－，NO2－

與加入的顯色劑對－氨基苯磺酸和α－萘胺反應生成玫瑰紅色的偶氮化合物，在520nm處比色可測定產(chǎn)物的生成量。一些脫氫酶以NAD+或NADP+為輔酶，NAD+或NADP+在340nm處光吸收很少，而其還原形式NADH和NADPH在340nm處光吸收較大，因此可以測定340nm處的光吸收變化來檢測NADH和NADPH的生成或減少，從而得知脫氫酶的活性。乳酸脫氫酶催化的反應乳酸脫氫酶2旋光測定法（polarimetry）

若底物和產(chǎn)物的旋光性不同，可通過測定反應混合物的旋光性（方向和大?。┳兓瘉頊y定酶活性。3熒光法（fluorescence）

氧化態(tài)的黃素（flavin）化合物發(fā)出強烈的熒光，還原態(tài)失去熒光。NAD+

和NADP+無熒光，而NADH和NADPH有460nm藍色熒光。熒光法靈敏度高。4同位素測定法（isotopedetermination）

用放射性同位素標記底物，酶反應后分離產(chǎn)物，測產(chǎn)物的放射性強度。此法靈敏度高，但分離產(chǎn)物較麻煩。若底物或產(chǎn)物中有一種是氣體或沉淀，就易于分離。5電化學方法（electrochemistry）

①pH測定：對于某些酶促反應過程中會產(chǎn)生H＋或減少H＋的反應來說，用1/1000pH單位精度的pH計測定反應液的pH變化，或為保持pH不變而加入酸或堿，記錄一段時間內加入的酸堿量。②電位測定：在一些酶促氧化還原反應中，底物和產(chǎn)物具有不同的氧化還原電位，可用由一恒定微電流極化的兩個鉑電極之間的電位差來測定電位變化。③電流測定：以恒定電壓的兩個鉑電極測電流變化。6化學分析法（chemicalanalysis）

酶促反應一段時間后，取出一部分反應液，用化學方法分析底物或產(chǎn)物的量。如ACC合成酶的產(chǎn)物ACC的測定：加HgCl2終止反應，加NaOCl-NaOH混合液使ACC轉化成乙烯，再用氣相色譜測乙烯。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）13.2、酶最適反應條件的測定

最適反應溫度溫度穩(wěn)定性最適反應pHpH穩(wěn)定性一、溫度對酶促反應的影響溫度-酶反應速率曲線與最適溫度（optimumtemperature）Fig.Theeffectoftemperatureonenzymeactivity.二、pH對酶促反應的影響pH-酶反應速率曲線與最適pH（optimumpH）Fig.TheeffectofpHonenzymeactivity.Tab.OptimumpHofsomeenzymes胃蛋白酶過氧化氫酶胰蛋白酶延胡索酸酶核酶精氨酸酶13.3、酶動力學參數(shù)的測定1．米氏方程Km為米氏常數(shù)（一）酶促反應酶促反應式米氏方程：K4（二）米氏常數(shù)Km1．Km的含義:

當Km=[S]時，V=

Vmax/2，Km值等于反應速率達到最大反應速率Vmax一半時的底物濃度。2．Km的意義Km是酶的一個特征性常數(shù)反映酶對底物親和力的大小鑒別酶的種類

判斷可逆反應的速率

（三）Vmax定義：Vmax表示在一定酶量時的最大反應速率，即酶完全被底物所飽和時的反應速率，與酶活性濃度呈正比。應用：計算酶的轉換數(shù)（TN，催化常數(shù)Kcat）單位時間內每個酶分子將底物分子轉換成產(chǎn)物的最大值。計算公式為：

(單位是s-1)計算時要保證酶的濃度單位與底物的濃度單位一致酶反應速度與[S]的關系1.[S]＜＜

Km時：

υ=Vmax[S]/

Km

一級反應2.若[S]＞＞Km時：

υ=Vmax

零級反應3.若[S]=Km時：

υ=1/2Vmax

Km值的求法：

根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk)-1/Km1/Vmax斜率=Km/VmaxFig.TheLineweaver-Burkdouble-reciprocalplot13.4、酶促反應的影響因素激活劑抑制劑1.激活劑激活劑（activator）無機離子中等大小的有機分子蛋白質金屬離子:無機陰離子:氫離子K+、Na+、Ca2+、Mg2+

、Zn2+

等。Cl-等。某些還原劑：GSH、Cys、Vc金屬螯合劑：EDTA提高酶活性。2．抑制劑對酶促反應速度的影響

抑制作用

inhibition抑制劑

inhibitor

抑制作用：酶分子中的必需基團的化學性質受到某種化學物質的影響而改變，導致酶活性降低，甚至喪失，但并未引起酶蛋白的變性作用。(1)不可逆抑制作用（irreversibleinhibition)抑制劑以共價鍵和酶分子上必需基團結合（牢固結合），使酶活性降低或喪失，這種抑制劑不能用透析、超濾等物理方法解除抑制作用。不可逆抑制專一性的不可逆抑制

非專一性的不可逆抑制(2)可逆抑制(ReversibleInhibition)

通常以非共價鍵與酶和（或）酶-底物復合物結合，使酶活性降低或消失。采用透析或超濾等物理方法可將抑制劑除去，使酶恢復活性。類型：競爭性抑制（competitiveinhibition）非競爭抑制（noncompetitiveinhibition）反競爭抑制（uncompetitiveinhibition）

1)競爭性抑制ki2ki1Vmaxv[S]（不變）KmKm(變大)WithcompetitiveinhibitorNoinhibitor?

競爭性抑制曲線VmaxKmv1=)[I][ki](1++Vmax1[S]11/[S][I]1/v[I][ki]-Km(1+)-1-1/KmNoinhibitorWithcompetitiveinhibitorFig.Lineweaver-Burkplotofcompetitiveinhibitio13.2)非競爭性抑制Fig.Noncompetitiveinhibition[S]vVmaxVmax（變?。㎏m(不變)NoinhibitorWithnoncompetitiveinhibitorFig.Noncompetitiveinhibitio13.NoinhibitorWithnoncompetitiveinhibitor[I]1/[S]1/v-1/KmVmax1[I][Ki](1+)[S]1VmaxKmv1=)[I][ki](1++Vmax1)[I][ki](1+3)反競爭性抑制1/v1/[S]-1/Km(1+[I]/ki)[I]正常表.三種抑制作用總結類型米氏方程VmaxKm無抑制劑v=Vmax[S]/(Km+[S])VmaxKm競爭性抑制v=Vmax[S]Ki/(Km

Ki+Km[I]+Ki[S])不變增加非競爭性抑制v=Vmax[S]Ki/(Km+[S])(Ki+[I])減小不變反競爭性抑制v=Vmax[S]Ki/(Km

Ki+[S]Ki+[S][I])減小減小13.5、實例

菲律賓蛤仔堿性磷酸酶的酶學性質研究最適溫度溫度穩(wěn)定性最適pHpH穩(wěn)定性酶動力學參數(shù)測定金屬離子對酶活性的影響有機溶劑對酶活性的影響酶活測定：取緩沖液2.4mL于試管中，加入0.5mL0.01mol/LPNPP，45℃水浴10min，加入0.1mL酶液，1min后加入1mL1mol/LNaOH終止反應。對照組先加入1mL1mol/LNaOH，再加入0.1mL酶液。最后用分光光度計測定405nm處的吸光度。一個酶活力單位定義：在此反應條件下，每毫升溶液每分鐘催化底物水解，產(chǎn)生1μmol產(chǎn)物所需的酶量。1、最適反應溫度

在pH9.0條件下，分別測定ALP在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃反應體系中的酶活力。以反應溫度為橫坐標，相對酶活力為縱坐標，繪制酶活變化曲線。2、溫度穩(wěn)定性研究將純酶液與適量0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH9.0，含0.1mol/LNaCl）混合，分別在25℃、35℃、45℃、55℃放置4h，每小時測定一次酶活力。以靜置時間為橫坐標，相對酶活力為縱坐標，繪制酶活變化曲線。3、最適反應pH

在最適反應溫度條件下，分別測定ALP在pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0反應體系中的酶活力。其中，pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的緩沖液為0.05mol/LTris-HCl緩沖液；pH9.5、10.0、10.5的緩沖液為0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液；pH11.0的緩沖液為磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液。以反應pH為橫坐標，相對酶活力為縱坐標，繪制酶活變化曲線。4、pH穩(wěn)定性研究

將純酶液與適量pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0的緩沖液混合，4℃冰箱內放置4h后，在最適反應溫度和最適反應pH條件下，測定剩余酶活力。其中，pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的緩沖液.05mol/LTris-HCl緩沖液；pH9.5、10.0、10.5的緩沖液為0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液；pH11.0的緩沖液為磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液。以反應時間為橫坐標，相對酶活力為縱坐標，繪制酶活變化曲線。5、酶的動力學參數(shù)測定

在最適溫度和最適pH條件下，測定不同底物濃度下的反應初速度（V），采用LineweaverBurk法作圖，求出米氏常數(shù)Km和最大反應速度Vmax。6、金屬離子對酶活性的影響

在酶活測定反應體系中加入不同濃度的金屬離子，其中加入氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣至終濃度分別為1mmol/L、5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L；加入氯化鋇、三氯化鐵、