第三章-細(xì)胞工程10

第三章細(xì)胞工程23.1細(xì)胞工程的基本技術(shù)細(xì)胞工程實驗室的常見設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法33.1.1細(xì)胞工程實驗室的常見設(shè)施滅菌鍋電熱干燥箱超凈工作臺倒置顯微鏡細(xì)胞計數(shù)板4電熱鼓風(fēng)干燥箱手提式高壓滅菌鍋立式高壓滅菌鍋垂直雙人雙面超凈工作臺離心機光照培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱液氮罐倒置顯微鏡細(xì)胞計數(shù)板5動物細(xì)胞培養(yǎng)中用于觀察細(xì)胞的生長狀況及計數(shù)。CO2培養(yǎng)箱（動物細(xì)胞培養(yǎng)）6光照培養(yǎng)箱（植物細(xì)胞培養(yǎng)）CO2培養(yǎng)箱主要控制模擬活體內(nèi)環(huán)境相關(guān)的3個基本變量：穩(wěn)定的CO2水平、溫度、相對濕度。液氮罐（用于凍存培養(yǎng)的動物細(xì)胞）73.1.2細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

——無菌操作

細(xì)胞工程的所有試驗都要求在無菌條件下進行，要求十分嚴(yán)格的無菌操作。

1、準(zhǔn)備室、接種室、培養(yǎng)室（紫外線、熏蒸等）；

2、超凈工作臺、高壓滅菌設(shè)備、過濾器；

3、生物材料的消毒（酒精、升汞、次氯酸鈉等）；

4、試驗器械、器皿的滅菌（干熱、濕熱）；

5、藥品、培養(yǎng)基的滅菌（濕熱、過濾）；8細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)是指動物、植物或微生物細(xì)胞在體外無菌條件下的保存和生長。(微生物培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)、動物細(xì)胞培養(yǎng))基本步驟包括：獲取原材料及除菌；配制培養(yǎng)基，對培養(yǎng)基進行滅菌；接種、培養(yǎng)和傳代。9細(xì)胞融合技術(shù)離體條件下將不同生物或同種生物不同類型的單細(xì)胞通過無性方式融合成一個雜合細(xì)胞的技術(shù)?！獑慰寺】贵w細(xì)胞融合技術(shù)的主要過程：制備原生質(zhì)體（植物）；誘導(dǎo)細(xì)胞融合（化學(xué)融合劑介導(dǎo)、電融合、病毒融合劑介導(dǎo)等）；篩選雜合細(xì)胞。10核移植用機械的辦法將供體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至另一個受體細(xì)胞（去除細(xì)胞核）中，并使這個重組細(xì)胞進一步發(fā)育、分化?！寺⊙駾olly113.2植物細(xì)胞工程12細(xì)胞的全能性(totipotence)1902年：德國植物學(xué)家哈伯蘭德（Haberlandt）就預(yù)言，植物細(xì)胞具有全能性，即植物活細(xì)胞具有能夠發(fā)育成為完整植株的潛在能力。1943年，懷特明確提出了“植物細(xì)胞全能性”學(xué)說：每個植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。植物細(xì)胞的全能性，是植物細(xì)胞工程創(chuàng)立的重要理論基礎(chǔ)。131997年多利羊誕生證明了動物細(xì)胞全能性3.2.1幾個基本概念*外植體、愈傷組織外植體：從健康植株的特定部位或組織，選擇用于組織培養(yǎng)的起始材料，稱之為外植體?？梢允瞧鞴?、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等（如：花粉、莖段、葉片、莖尖、胚等）。愈傷組織：原指從植物的傷口部位生成的脫分化的薄壁細(xì)胞團。組織培養(yǎng)時,則指在培養(yǎng)基上從外植體上長出的一團無序薄壁細(xì)胞。它具有再分化成為完整植物體的潛能。14水稻幼胚水稻愈傷組織細(xì)胞分化、脫分化、再分化分化（diffrentiation)：細(xì)胞的形態(tài)、構(gòu)造和功能發(fā)生變化，如花芽分化，木質(zhì)部分化，不定胚分化；脫分化（dediffrentiation)：培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程就是細(xì)胞脫分化；再分化（rediffrentiation)：將脫分化的母細(xì)胞再培養(yǎng)成分化細(xì)胞，并且形成組織或器官以及生物體；15水稻幼胚水稻愈傷組織脫分化分化出苗再分化植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基16糖（碳源），氨基酸，維生素等水：大量元素：K,Ca,Mg,P,S等微量元素：Cl,Fe,Mn,B,Zn,Cu,Co等無機營養(yǎng)：蒸餾水或去離子水有機營養(yǎng)：生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長素：2，4－D，NAA，IAA等。促進根的分化細(xì)胞分裂素：6－BA，玉米素，激動素等，促進芽的分化天然附加物：椰乳，酵母提取物，麥芽浸出物等植物生長所必須的元素：大量元素（9種）：C、H、O、N、K、Ca、Mg、P、S微量元素（7種）：Cl、Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mu3.2.2組織培養(yǎng)的基本方法進行植物組織培養(yǎng)，一般要經(jīng)歷以下五個階段：171.材料的準(zhǔn)備；2.接種與培養(yǎng)；3.繼代增殖；4.誘導(dǎo)分化、生根成芽；5.移栽、煉苗成活。18水稻幼胚水稻成熟胚愈傷組織分化出苗誘導(dǎo)成芽誘導(dǎo)生根(底面觀)誘導(dǎo)生根（側(cè)面觀）移栽、煉苗193.2.3快速繁殖技術(shù)植物快速繁殖技術(shù)（快繁）：利用組織培養(yǎng)方法將植物體某一部分的組織小塊，進行培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化成大量的小植株，從而達到快速無性繁殖的目的。也稱為試管苗繁殖或微體繁殖。20快繁技術(shù)最早在蘭花工業(yè)上獲得成功。在20平方米的培養(yǎng)室內(nèi)，最多可容納100萬株試管苗。213.2.4植物脫毒技術(shù)是植物快繁的一個分枝1952年，法國科學(xué)家首次建立了生長點培養(yǎng)成株的脫毒法，從而開創(chuàng)了防治植物病毒病的新途徑。對植物病毒病迄今已采用的生物、物理、化學(xué)等多種防治途徑均收效甚微，有的毫無成效。因此，過去人們只能采取拔除并消毀病株的消極方法。22原理在感染病毒的植株中，病毒的分布是不一致的。老葉片及成熟組織和器官中，病毒含量較高，但幼嫩的和未成熟的植物部位（如莖尖分生組織），病毒的含量較低，而在生長點約0.1～1毫米時，則幾乎不含病毒顆粒。這是由于病毒的繁殖運輸速度與莖尖細(xì)胞生長速度不同所致。在莖尖分生組織中，細(xì)胞繁殖十分迅速，病毒還來不及侵入，因此就成為植物體相對無病毒的特殊區(qū)域。23采取不含病毒顆?；虿《绢w粒含量甚少的0.1～0.5毫米帶1～2個葉原基的莖尖作為外植體，進行微繁殖，使其培養(yǎng)成完整的無病毒小植株的技術(shù)。所取的外植體很小，分離難度大，一般在解剖鏡下操作。馬鈴薯、洋蔥、大蒜、蘭花、菊花、康乃馨、水仙、唐菖蒲、香蕉、蘋果、柑橘、葡萄等。24華中農(nóng)大馬鈴薯脫毒試管苗253.2.5次生物質(zhì)與植物細(xì)胞的大量培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物是指生物中一大類并非生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。那些應(yīng)用價值高，價格昂貴，資源不足，難以進行化學(xué)合成的植物次生物質(zhì)，用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)才會有經(jīng)濟上的效益。

261956年，提出工業(yè)化培養(yǎng)植物細(xì)胞以生產(chǎn)其天然產(chǎn)物。之后，用此方法生產(chǎn)了紫草寧、哈爾堿、麻黃堿、人參皂角苷、紫杉醇等。《本草綱目》中所開列的1892種藥物中絕大多數(shù)是植物；目前約有25%的法定藥品來自植物。第一個商品化的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的植物是紫草。1983年，日本三井石油化學(xué)工業(yè)公司利用紫草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧，最終濃度達1400mg/L，宣布把紫草寧作為燃料和藥物進行工業(yè)化生產(chǎn)。在搖床擴大培養(yǎng)的長春花細(xì)胞27紫草我國已經(jīng)建立了人參、三七、西洋參、三尖杉、紫草、洋地黃、長春花、丹參、紅豆杉等40多種藥用植物的液體培養(yǎng)系統(tǒng)，并對長春花、人參、紫草、紅豆杉等進行大規(guī)模培養(yǎng)的探索。長春花28紅豆杉紅豆杉樹皮中提取的紫杉醇對治療卵巢癌和乳腺癌有特效。這種物質(zhì)的碳環(huán)結(jié)構(gòu)十分特殊，難以通過化學(xué)合成獲得。然而要治好一個卵巢癌病婦，至少需要2～3棵60老齡的此種樹的樹皮。這種樹屬于稀有樹種，且生長很慢，若不斷取用的話，很快就要面臨瀕危的境地。我生物技術(shù)產(chǎn)物第一個商品化的例子：人參，中國藥科大學(xué)組培室人參3.2.6原生質(zhì)體培養(yǎng)與細(xì)胞融合是指將不同來源的原生質(zhì)體(除去細(xì)胞壁的細(xì)胞)相融合并使之分化再生、形成新物種或新品種的技術(shù)?？梢员荛_生殖細(xì)胞的受精過程，在親緣更遠(yuǎn)的物種間實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造出自然界中所沒有的新物種。目前仍以種內(nèi)和種間的細(xì)胞雜種為主。29顯微鏡下的細(xì)胞融合過程細(xì)胞融合的方法物理法（電）、化學(xué)法（化學(xué)融合劑）及生物法（病毒融合劑）。原理：增加細(xì)胞間的粘附、改變膜的通透性——隨機結(jié)合、融合植物細(xì)胞融合常用PEG法和電融合法。30目前，最常用的植物細(xì)胞融合技術(shù)，有高國楠建立的使用化學(xué)融合劑PEG（聚乙二醇）的融合技術(shù)（1974），森達和喬默爾曼創(chuàng)立和發(fā)展的電融合技術(shù)，以及斯維格（1987）將電融合與微培養(yǎng)結(jié)合起來的技術(shù)。31植物原生質(zhì)體融合過程3.2.7人工種子人工種子又稱人造種子，這是細(xì)胞工程中最年輕的一項新興技術(shù)。由英國科學(xué)家于1978年提出的。天然種子，一般都是由種皮、胚乳和胚三部分構(gòu)成。人工種子是由體細(xì)胞胚、人工胚乳和人工種皮三個部分組成。32體細(xì)胞胚胚不一定從受精卵發(fā)育來，尤其在植物界，往往可以看到未受精的卵細(xì)胞或胚囊細(xì)胞、珠心細(xì)胞等發(fā)育成胚的現(xiàn)象。由體細(xì)胞發(fā)育成的類似于合子胚的結(jié)構(gòu)成為胚狀體或體細(xì)胞胚，簡稱體胚。體胚具有兩極性，可從方向相反的兩端分化出莖和根。因此，體胚可以一次性再生成完整植株。把體胚包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具備種子機能。所以，人工種子是一種人工制造的代替天然種子的顆粒體，可以直接播種于田間。33馬鈴薯人工種子包埋介質(zhì)海藻酸鈉這種物質(zhì)在0.1M氯化鈣溶液中可以迅速固化成透明的小膠球。海藻酸價格低廉，質(zhì)地柔軟無毒性，還可人為地在其中加入各種營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑，因此是一種，迄今為止已發(fā)現(xiàn)的比較理想的體細(xì)胞胚包埋劑。34美國的一個研究組花了近兩年時間，從百余種材料中篩選到目前廣泛使用的人工種子包埋介質(zhì)海藻酸鈉。三大難題有待克服①許多重要植物還不能培養(yǎng)出大量的高質(zhì)量的體細(xì)胞胚。②現(xiàn)有的人工胚乳和種皮還不夠理想，不能有效地防止微生物的腐蝕。③人工種子的貯藏有待進一步完善。35目前已制成模式性人工種子的植物十余種，但距離實際應(yīng)用還有很大距離。3.3動物細(xì)胞工程3.3.1動物細(xì)胞培養(yǎng)3.3.2動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程3.3.3體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞的生長類型3.3.4動物細(xì)胞培養(yǎng)條件3.3.5動物細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇3.3.6動物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用363.3.1動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)：從動物體內(nèi)取出細(xì)胞（或組織），模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞（或組織）生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能。起源于19世紀(jì)所應(yīng)用的某些胚胎學(xué)技術(shù)。奠基人:美國生物學(xué)家哈里森。在1907年采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，保持存活了幾周時間，并觀察到細(xì)胞突起的生長過程。37培養(yǎng)器具38過濾器離心管培養(yǎng)瓶凍存管幾個概念原代培養(yǎng)期（10代細(xì)胞以內(nèi)）傳代培養(yǎng)期（10代細(xì)胞以后）細(xì)胞株：（10-50代細(xì)胞）細(xì)胞系：（50代細(xì)胞以后，細(xì)胞發(fā)生了癌變）39原代培養(yǎng)(primaryculture)把第1代細(xì)胞的培養(yǎng)與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)。40過程：從動物機體中取出組織剪碎加胰蛋白酶細(xì)胞游離加培養(yǎng)液將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)（1—2天換一次培養(yǎng)液）細(xì)胞貼壁生長長成單層細(xì)胞細(xì)胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長，如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。傳代培養(yǎng)(subculture)體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。4142細(xì)胞株：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出進行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，能傳到40-50代，其遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生變化。細(xì)胞系：體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞傳到40-50代后有部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化，帶有癌變的特點，可能在培養(yǎng)條件下無限制的傳代下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。在進行動物細(xì)胞培養(yǎng)時，用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的pH為7.2－7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（最適pH2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。3.3.2動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程43選材：多選擇動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，因為它們細(xì)胞增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng)。44基本過程：動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細(xì)胞懸浮液胰蛋白酶10代細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞50代細(xì)胞細(xì)胞株無限傳代細(xì)胞系單個細(xì)胞加培養(yǎng)液遺傳物質(zhì)未改變動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）遺傳物質(zhì)已改變3.3.3體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞的生長類型離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞可分為三類：貼壁依賴性貼壁非依賴性兼性貼壁細(xì)胞。45貼壁依賴性細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞需有給予貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼壁因子才能在該表面上生長、增殖。這樣的細(xì)胞稱為貼壁細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞布滿表面后即停止生長，這時若取走一片細(xì)胞，存留在表面上的細(xì)胞就會沿著表面生長而重新布滿創(chuàng)面。要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。46接觸抑制當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。

正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的，而異倍體細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，其壽命是無限的，如腫瘤細(xì)胞。4748培養(yǎng)中的胃癌細(xì)胞MGC-803（多層）貼壁非依賴性細(xì)胞體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，細(xì)胞透明度較大，邊緣不是那么清晰，故也叫懸浮型細(xì)胞。一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細(xì)胞，當(dāng)接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長。血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等都屬此類細(xì)胞。這類細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點是胞體始終為球形。49兼性細(xì)胞生長不嚴(yán)格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。3.3.4動物細(xì)胞培養(yǎng)條件1、無菌、無毒的環(huán)境（添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營養(yǎng)要求高（葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。）3、環(huán)境要求高：溫度和pH36.5+0.5度,7.2-7.44、氣體環(huán)境：

O2和CO2（95%空氣和5%CO2

）50保證細(xì)胞順利的生長增殖不同血清對細(xì)胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和馬血清次之。3.3.5動物細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇冷凍保存：將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇：以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫。51冷凍保存方法

最常用的方法：利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-70℃

～-80℃

，然后直接投入液氮進行保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。5253獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物細(xì)胞的全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物個體或細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞增殖原理動物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目植物細(xì)胞和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較3.3.6動物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用利用體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞來大規(guī)模生產(chǎn)生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體）獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，用于植皮培養(yǎng)的動物細(xì)胞可以用于檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性為治療和預(yù)防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù)543.4單克隆抗體長期以來，為了獲得抗體，采用的是把某種抗原反復(fù)注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體，只能是混合抗體,產(chǎn)量低，特異性差，純度低，反應(yīng)不夠靈敏。人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)的B細(xì)胞可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每個B細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個B細(xì)胞進行無性繁殖，即克隆。5556什么是抗體？由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里？起何作用？什么是單克隆抗體？B細(xì)胞血清特異性免疫作用抗體：機體受抗原刺激后產(chǎn)生的，并且能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。用單個B淋巴細(xì)胞進行無性增殖（擴增），也就是通過克隆，形成細(xì)胞群，這樣的細(xì)胞群就有可能產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體——單克隆抗體3.4.1幾個基本概念57傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞一種抗原通常具有多個不同的抗原決定簇，因此能刺激多個B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。傳統(tǒng)方法獲得的抗體是多克隆抗體(混合抗體)58設(shè)計方案：一個B淋巴細(xì)胞－－只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞－－能無限增殖化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強，只針對一種抗原決定簇的抗體。雜合細(xì)胞單克隆抗體3.4.2單克隆抗體的制備過程591975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與用綿羊紅細(xì)胞免疫過的小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體。60

單克隆抗體制備過程注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體誘導(dǎo)其融合的方法有哪些？兩次篩選分別有什么目的？為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？61雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖①動物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備腹腔注射、皮下淋巴樣器官注射、靜脈注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射等如果需要免疫脾細(xì)胞，一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。

62

單克隆抗體制備過程63

小白鼠免疫流程抗原混合弗氏完全佐劑進行初次免疫至少三次相同劑量的加強免疫效價測定最后一次加強免疫取出脾臟，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞融合BALB/c02468101214wk試采血加佐劑制成乳劑佐劑:能使抗原緩慢釋放，以便延長抗原與免疫系統(tǒng)接觸的時間；產(chǎn)生高親和力的免疫應(yīng)答64②免疫后取出脾臟65

脾臟為B細(xì)胞集中地取出脾臟內(nèi)細(xì)胞（無菌條件下操作。）66③PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合細(xì)胞融合2min加入

PEG67④培養(yǎng)、篩選融合后的細(xì)胞均分在96孔板中HAT培養(yǎng)基：這一步篩選，主要是篩選出雜合的瘤細(xì)胞。68

融合后的細(xì)胞生長狀況剛?cè)诤贤瓿梢粋€癌細(xì)胞與兩個脾臟細(xì)胞經(jīng)數(shù)次分裂后穩(wěn)定的細(xì)胞群落JuangRH(2003)69PEG脾臟細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合HAT初步篩選雜合細(xì)胞ELISA篩選抗體mm11133332m143m12342mmmm3412mm431mmmmmm22244443.4.3單克隆抗體的應(yīng)用醫(yī)學(xué)檢驗試劑：主要用于特異性、敏感性要求高的的實驗技術(shù)中，如傳染病的快速診斷；尋找腫瘤特異性抗原及檢測腫瘤相關(guān)抗原；免疫細(xì)胞抗原檢測，等等（主要是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)檢測特異性抗原）。導(dǎo)向治療：生物導(dǎo)彈或免疫導(dǎo)彈抗原物質(zhì)的分離和提純：親和層析中作為配體，可篩選特異性抗原物質(zhì)703.5核移植與克隆動物71一、什么是克隆即由同一個祖先細(xì)胞分裂而形成的純細(xì)胞系，這個細(xì)胞系每個細(xì)胞的基因彼此是相同的。低等的無脊椎動物中－－－常見脊椎動物－－－未見分子水平克?。篜CR技術(shù)細(xì)胞水平克?。簞游锛?xì)胞培養(yǎng)（單克隆抗體）個體水平克?。嚎寺⊙蚨嗬裁词强寺〖夹g(shù)是一種人工誘導(dǎo)的無性繁殖方式。二、（動物細(xì)胞的）核移植74將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中,使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育,使得核供體的基因得到完全復(fù)制。將早期胚胎、胎兒或成體動物的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，重新組成重構(gòu)胚并使之發(fā)育成成體動物的過程。胚胎核移植在多種動物上獲得了克隆后代:綿羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(張勇等,1991)等。1997年，由

Mengetal成功地克隆出兩只猴,這是靈長類動物的首次被克隆。

1938年漢斯·斯皮曼（克隆之父）蠑螈受精卵的結(jié)扎實驗

（一）、核移植技術(shù)的發(fā)展簡史HansSpemann分化了的細(xì)胞核移入卵子中能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育？1952年美國費城癌癥研究院Briggs和King兩棲類囊胚的細(xì)胞核移植羅伯特?布里格斯Robert

Briggs

(1911-1983)ThomasKing(1921-2000)1952:Briggs&Kingclonefrogs

1958年到1962年，英國劍橋大學(xué)的JohnGurdon和Machineer利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細(xì)胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾．1970年JohnGurdon以同樣的方法，用青蛙腳蹼角質(zhì)化細(xì)胞進行移核試驗，蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。童第周

上個世紀(jì)60年代，童第周對金魚、鯽魚進行細(xì)胞核移植。1978年又成功地進行了黑斑蛙的克隆試驗，他將黑斑蛙的紅細(xì)胞的核移入事先除去了核的黑斑蛙卵中，這種換核卵最后長成能在水中自由游泳的蝌蚪。生物遺傳性狀是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)相互作用結(jié)果

“童魚”開創(chuàng)了人類按照需要進行人工培養(yǎng)新物種的先例，對培育動植物新品種具有重大指導(dǎo)的意義。（二）、核移植分類根據(jù)核供體細(xì)胞來源的不同1.胚胎細(xì)胞的核移植2.體細(xì)胞的核移植根據(jù)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞是否來于同一種動物又可將其分為1.同種核移植2.異種核移植兩類。胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)胚胎細(xì)胞核移植(embryocelluncleartransplantation)技術(shù)。將一個早期胚胎的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建新合子的生物技術(shù)，通常將提供細(xì)胞核的細(xì)胞稱為供體，接受細(xì)胞核的卵母細(xì)胞稱為受體。此后，胚胎細(xì)胞的核移植在多種動物上獲得了克隆后代:綿羊(斯蒂恩·威拉德森等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(張勇等,1991)等。1997年，由

成功地克隆出兩只猴,這是靈長類動物的首次被克隆。

哺乳動物體細(xì)胞核移植技術(shù)動物克隆技術(shù)的里程碑里程碑式的突破英國羅斯林（Roslin）研究所維爾穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在《Nature》宣布用乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核成功克隆出一只綿羊“多莉(Dolly)”

。

88維爾穆特等試驗的生物學(xué)意義是證明了哺乳動物的體細(xì)胞也具有全能性。在此之前，人們從未能從哺乳動物的已分化的體細(xì)胞再培育出基因相同的個體。但是，他們的試驗尚未解決直接從體細(xì)胞培養(yǎng)成成體的問題，他們還需借助于卵細(xì)胞，即還要依賴卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。綿羊“多莉”整個克隆過程如下：母綿羊A乳腺細(xì)胞

（體細(xì)胞）

母綿羊B未受精的卵細(xì)胞

母綿羊C“DollyParton”新的卵細(xì)胞發(fā)育成胚胎去核卵細(xì)胞提取細(xì)胞核細(xì)胞融合胚胎移植HelloDolly!為什么？卵母細(xì)胞核位置靠近第一極體，便于一并吸出。通常用10代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞，為什么？1切開卵母細(xì)胞透明帶2擠出卵母細(xì)胞細(xì)胞核3注入供體細(xì)胞核4電融合儀融合123455、培養(yǎng)胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植的方法

1998年7月，美國夏威夷大學(xué)Wakayama等報道，由小鼠卵丘細(xì)胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，這是繼“多莉”以后的第二批哺乳動物體細(xì)胞核移植后代。此后，體細(xì)胞核移植技術(shù)在牛、山羊、豬等多種動物獲得成功。。至1999年底，全世界已有6種類型細(xì)胞——胎兒成纖維細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、輸卵管／子宮上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和耳部皮膚細(xì)胞的體細(xì)胞克隆后代成功誕生。2000年，楊向中博士領(lǐng)導(dǎo)的實驗室在美國從體外培養(yǎng)6-13代的細(xì)胞克隆出6頭公牛。2000年，美國從衰老細(xì)胞克隆出6頭小牛。2000年，英國從成年動物體細(xì)胞克隆出5頭豬。2000年，中國西北農(nóng)林科技大學(xué)從4歲山羊耳上取細(xì)胞體外培養(yǎng)，克隆出1頭山羊。2001年，體細(xì)胞克隆狗誕生。2001年，體細(xì)胞克隆兔誕生。2002年，體細(xì)胞克隆貓誕生。2003年，體細(xì)胞克隆猴誕生。2004年，體細(xì)胞克隆大鼠誕生。2005年，體細(xì)胞克隆馬誕生。962005:我國第一頭體細(xì)胞克隆豬克隆

小香豬

世界首例體細(xì)胞克隆水牛在廣西大學(xué)誕生

成功率始終很低，具有極大的偶然性和隨機性。277個綿羊胚胎——1個多莉；夭折率高，不少克隆動物天生患有疾病或體形過大；沒有遺傳物質(zhì)的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。4存在問題99Dolly的命運：2003年2月14日，多莉因肺部感染無法治愈而死亡，“享年”不足7歲。肺部感染是11-12歲的老年羊的常見病。1999年，法國全國農(nóng)業(yè)研究所的克隆牛犢出生一月后死亡。尸體解剖發(fā)現(xiàn)其脾臟、胸腺等組織未正常發(fā)育。應(yīng)用價值及意義檢驗動物細(xì)胞全能性加速動物繁殖、優(yōu)良育種、保護珍貴動物。生殖性克隆克隆動物的遺傳背景相同，因此它們是模擬疾病、基因治療、器官移植等研究的良好實驗材料，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性?？梢杂没颊弑救思?xì)胞培育出新組織（器官移植）。治療性克隆1005生殖性克隆101人體細(xì)胞克隆技術(shù)生殖性克?。寺∪耍┲委熜钥寺。寺∨咛ィ┏鲇卺t(yī)療目的而在實驗室使用克隆技術(shù)制造胚胎，然后取出胚胎干細(xì)胞進行體外培養(yǎng)以獲得再生組織或器官的過程?！吧承钥寺　保褐赋鲇谏车哪康氖褂每寺〖夹g(shù)在實驗室制造人類胚胎，然后將胚胎置入人類子宮發(fā)育成胎兒和嬰兒的過程?；谧鹬厝祟愖饑?yán)的倫理學(xué)考慮，目前世界各國政府嚴(yán)禁生殖性克隆?！爸委熜钥寺　保嚎寺∪祟?？將普通的體細(xì)胞（男性或女性來源均可）和一枚女性卵子結(jié)合起來（儲存于女性卵子中的遺傳信息將事先被消除）。通過細(xì)胞分裂形成的胚胎應(yīng)只帶有這名供體的全部遺傳信息，最后將胚胎移植到女性子宮中，將獲得該供體人類的克隆后代。102社會、倫理問題他（她）是正常人嗎？該如何看待他（她）？他（她）的父母是誰？誰生育了他（她）？誰愛他（她）？有可能產(chǎn)生真正相同的克隆的孿生子嗎？103Whoami？不管克隆技術(shù)怎樣發(fā)展，克隆人怎樣產(chǎn)生，都是人，與被克隆人實質(zhì)上是存在著年齡差的同胞胎。但就是這一點讓人們覺得很難應(yīng)對克隆人出現(xiàn)的倫理關(guān)系。這個孩子就是人類的試驗品，這位代孕的母體起到的也僅僅是一個生育機或孵化器的作用。英雄、偉人能夠克隆嗎？身體上任何一部分的細(xì)胞是否都可以用來克隆？人可以無休止地被克隆嗎？任何克隆動物都有基因上的缺陷?？寺⊙蚝涂寺∨６加畜w形過度龐大的問題。該缺陷在克隆鼠身上也存在?？寺∨?、羊、豬都存在發(fā)育不良、免疫系統(tǒng)缺陷和心肺功能不健全的問題。那么，克隆人呢？104克隆人是否是人類文明的倒退？（有性生殖，無性生殖——克隆）105106

1998年1月，歐洲19個國家在法國巴黎簽署了一項有關(guān)嚴(yán)格禁止克隆人的協(xié)議。這是國際上第一個禁止克隆人的文件。它禁止各簽約國的研究機構(gòu)或個人使用任何技術(shù)創(chuàng)造與一個活人或死人基因相似的人，否則將重罰。美國：2001年7月31日，美國國會眾議院通過了一項全面禁止克隆人的法案。美國總統(tǒng)布什表示“百分之百”反對克隆人的研究，并已多次敦促參議院通過禁止克隆人的法案。英國：1990年通過的《人類授精和胚胎學(xué)法案》，認(rèn)為克隆人類胚胎的研究是非法的。2001年11月22日英國政府公布一項新法案，明確禁止通過克隆技術(shù)復(fù)制人類個體，即“繁殖性克隆”，成為世界上第一個立法反對生殖性克隆的國家。德國：1991年德國實行《胚胎保護法》，嚴(yán)格禁止人類胚胎干細(xì)胞研究以及克隆胚胎干細(xì)胞。2000年11月，德國衛(wèi)生部提出一項新的《生殖醫(yī)學(xué)法》草案，再次強調(diào)在德國不允許進行胚胎干細(xì)胞的培育研究。意大利：2001年3月，意大利眾議院批準(zhǔn)了政府于1998年簽署加入歐洲禁止克隆人協(xié)議。日本：2000年4月14日，日本內(nèi)閣會議通過關(guān)于《限制對人的克隆技術(shù)的法律草案》，禁止克隆人，違者最高將被判處5年徒刑。世界一些國家對克隆人研究的態(tài)度：從需要救治的病人身上提取體細(xì)胞將該細(xì)胞的遺傳物質(zhì)置入一個去除了細(xì)胞核的卵細(xì)胞該卵細(xì)胞開始自行分裂，直至形成一個早期胚胎從這早期胚胎中提取胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)的技術(shù)處理，便可發(fā)展成遺傳特征與病人完全吻合的細(xì)胞、組織或器官107以前器官移植治療方法中經(jīng)常出現(xiàn)的排異反應(yīng)問題因此得到了徹底解決血細(xì)胞、腦細(xì)胞、骨骼和內(nèi)臟等都將可以更換癌癥、白血病、帕金森氏癥、心臟病等頑疾也有望得到有效的治療與治愈由于從早期人類胚胎中提取的干細(xì)胞擁有形成所有的人體細(xì)胞類型的能力，因而它也就有可能成為21世紀(jì)最重要、最理想的人體器官替代物的原料。6治療性克隆治療性克?。双F混合胚胎中國最早進行人獸混合胚胎實驗，現(xiàn)已中斷/tech/2007-09/27/content_6801227.htm英國批準(zhǔn)人獸雜交胚胎研究/article/2007/0907/A20070907814001.shtml108人卵子的來源有限，無法大規(guī)模進行。為此科學(xué)家們就考慮把人的體細(xì)胞移植到去核的動物卵母細(xì)胞中，讓其發(fā)育成為一個混合的異種克隆胚胎進行胚胎干細(xì)胞研究，進行“胞質(zhì)雜交”，獲得完全具有人類性狀的干細(xì)胞胚胎。由此培養(yǎng)出的胚胎干細(xì)胞可能幫助找到某些疾病的源頭，如與脊髓有關(guān)的肌肉萎縮、帕金森氏癥或阿爾茨海默氏癥等。進行人獸混合胚胎研究的目的主要是用于治療性克隆研究。通過培育人獸混合胚胎，可以得到大量的干細(xì)胞。而干細(xì)胞可以分化成人體的各種組織和器官，在器官移植和探尋像帕金森氏癥、糖尿病等疾病的病因方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。3.6干細(xì)胞1093.6.1定義干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。or具有多項分化潛能和自我復(fù)制、更新能力的原始未分化細(xì)胞，是形成各種組織器官的祖宗細(xì)胞。110111來源胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ESC）：指處于胚胎早期的干細(xì)胞。分化潛能寬，具有分化為機體任何組織細(xì)胞的能力，如囊胚期(受精后5~7天)內(nèi)細(xì)胞團的細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞3.6.2干細(xì)胞的分類成體干細(xì)胞（adultstemcell，ASC）：具有自我更新能力，但分化潛能窄，只能分化為相應(yīng)(或相鄰)組織器官組成的細(xì)胞，如：骨髓、大腦、神經(jīng)、皮膚、胰腺、角膜、脂肪、心臟、肝臟等組織源干細(xì)胞112分化潛能單能/專能/偏能/定向干細(xì)胞：只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化。如上皮組織基底層的干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)。全能干細(xì)胞：具有形成完整個體的分化潛能。如：受精卵、8個細(xì)胞期以前的卵裂球以及胚胎干細(xì)胞（后者尚有爭議）多能干細(xì)胞（pluripotentstemcells）：具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，但失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定限制。如骨髓多能造血干細(xì)胞，它可分化出至少十二種血細(xì)胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細(xì)胞。3.6.3干細(xì)胞的生物學(xué)特點具有自我更新能力和不同程度的多向分化潛能終生保持未分化或低分化特征，缺乏分化標(biāo)記能無限地分裂、增殖，可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)保持靜止?fàn)顟B(tài)113